青少年群体酗酒和人口老龄化已成为两大社会问题。防止酗酒造成的损害以及延缓衰老已成为目前人们关注的焦点。青少年酗酒男性比例明显多于女性,酗酒者女性比男性对脑的损害幅度更大,暗示睾酮水平的变化与之密切相关。脑是酒精作用的主要靶器官之一,氧化应激损害参与了酗酒导致的脑结构和功能的改变。衰老是神经退行性疾病的危险因素,与衰老相关的神经退行性疾病,如帕金森病(Parkinson’s disease,PD),多发于老年男性;睾酮低下的男性增加了阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的发病风险;而老年男性血清睾酮水平显著降低,提示睾酮在神经退行性疾病中的潜在作用。既往研究发现衰老与氧化还原失衡而致的线粒体氧化应激损害有关,老年雄激素水平的降低与衰老过程中线粒体功能障碍很可能存在着密切的联系。线粒体是双膜性细胞器,由线粒体内膜包绕的线粒体基质,含有完成三羧酸循环及参与氧化还原反应的成份;线粒体内外膜之间为膜间腔,含有高浓度的质子,是保持线粒体膜电位的必要条件。电子传递链(Electron transport chain,ETC)包括四个线粒体复合物(I、II、III、IV),定位于线粒体内膜,是电子传递和ATP生成的分子结构。与其它细胞器不同,线粒体含有自己的DNA(Mitochondrial DNA,mt DNA),其中包括mt DNA编码的线粒体复合物I的7个亚基(ND1、2、3、4、4L、5和6)、线粒体复合物III的1个亚基、线粒体复合物IV的3个亚基以及线粒体复合物V的2个亚基。线粒体对保障哺乳动物细胞,特别是神经元的正常功能活动至关重要。线粒体结构和功能的异常可以导致衰老相关的神经退行性疾病。线粒体是活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的主要来源,也是ROS损伤的主要靶目标。在线粒体功能减弱时,ROS产生增多,细胞氧化-还原平衡能力降低及氧化应激损害增加。因此,本研究通过(1)建立丙酸睾酮(Testosterone propionate,TP)酒精处理去势大鼠模型,观察氧化应激损害的影响;(2)建立TP处理老年大鼠模型,观察线粒体功能障碍的影响;(3)建立TP处理去势大鼠模型,检测线粒体功能的改变。探讨雄激素在线粒体功能障碍中的作用。第一部分丙酸睾酮在酒精处理大鼠氧化应激损伤中的参与目的:观察去势酒精大鼠脑内氧化应激参数的改变,补充丙酸睾酮是否能够改善氧化应激参数的改变。方法:(1)选用成年雄性SD大鼠,建立不同剂量TP处理去势大鼠模型,确定TP改善去势大鼠相关行为和氧化应激参数的最佳剂量,动物分组包括正常组(Intact)、假手术组(Sham)、去势组(GDX)和GDX-TP组(0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5及3mg/kg);(2)以TP最佳剂量处理酗酒去势大鼠,动物包括Intact、Sham、GDX、GDX-TP、去势酒精组(GDX-eth)、GDX-TP-eth和正常酒精组(Intact-eth),利用旷场实验和生物化学检测,分析大鼠旷场行为和氧化应激参数的变化。结果:1 TP剂量筛选的研究(1)旷场行为:GDX组大鼠的探索行为和运动行为参数与Sham组相比均显著降低(P<0.01);TP处理从0.5mg/kg到3.0mg/kg使GDX大鼠的这两种行为参数分别增加;0.75、1.0或1.25.0mg/kg TP处理使GDX大鼠的这两种行为参数恢复到Sham组水平。(2)Morris水迷宫定位航行:Sham、GDX和GDX-TP组在行为学测试的第3天、第4天与第5天存在显著性差异(P<0.01)。GDX组在第3天、第4天和第5天与同一天Sham组相比逃避潜伏期明显增加(P<0.01);0.75、1.0和1.25 mg/kg组与同一天GDX组相比逃避潜伏期缩短并恢复到同一天Sham组水平。空间探索:GDX组大鼠的目标象限(第4象限)时间百分比和穿越平台次数与Sham组相比均显著减少(P<0.01);TP处理在0.75、1.0和1.25mg/kg组使GDX大鼠的目标象限(第4象限)时间百分比和穿越平台次数分别增加(P<0.01),恢复到Sham组水平。(3)氧化应激参数抗氧化物参数:GDX组大鼠SN和HIP线粒体的Mn-SOD、GSH-PX活力及GSH的量与Sham组相比均显著减少(P<0.01);GDX-TP组中,在1.0mg/kg TP时GDX大鼠SN和HIP线粒体的Mn-SOD、GSH-PX活力及GSH的量达到峰值,与Sham组没有显著区别。脂质过氧化物参数:GDX组大鼠SN和HIP线粒体的MDA和LPO的量与Sham组相比均显著增加(P<0.01),在1.0mg/kg GDX-TP组,GDX大鼠SN和HIP线粒体的MDA和LPO的量达到反向峰值,与Sham组没有显著区别。2 TP处理酗酒去势大鼠的行为和氧化应激(1)旷场行为:与Intact组相比,Intact-eth组的静止闻嗅次数、探索行为次数和旷场中心区域活动时间显著减少、理毛潜伏期缩短(P<0.01);理毛数量、理毛持续时间和运动行为参数增加。与Sham组相比,GDX组大鼠静止闻嗅、探索行为、运动行为、理毛数量和理毛持续时间参数降低。GDX大鼠给予1.0mg/kg TP后,静止闻嗅、探索行为、运动行为、理毛数量和理毛持续时间参数恢复到Sham组水平。与GDX-eth组大鼠相比,GDX-TP-eth组静止闻嗅、旷场中心区域活动时间和理毛潜伏期减少;理毛数量、理毛持续时间以及运动行为参数增加。(2)氧化应激参数抗氧化物参数:Intact-eth组大鼠与Intact组相比显著减少了SN线粒体的Mn-SOD、GSH-PX活力和GSH的量(P<0.05)。GDX组大鼠SN线粒体的Mn-SOD、GSH-PX活力及GSH的量与Sham组相比均显著减少(P<0.01);1.0mg/kg TP处理使GDX大鼠SN线粒体的Mn-SOD、GSH-PX活力及GSH的量恢复到Sham组水平。GDX-TP-eth组大鼠SN线粒体的Mn-SOD、GSH-PX活力及GSH的量与GDX-eth组相比明显增加(P<0.01)。脂质过氧化物参数:Intact-eth组大鼠与Intact组相比显著增加了SN线粒体MDA和LPO的量(P<0.01)。GDX组大鼠SN线粒体MDA和LPO的量与Sham组相比均显著增加(P<0.01);1.0mg/kg TP处理使GDX大鼠SN线粒体MDA和LPO的量恢复到Sham组水平。GDX-TP-eth组大鼠SN线粒体MDA和LPO的量与GDX-eth组相比明显减少(P<0.01)。小结:1去势大鼠补充0.75、1.0或1.25 mg/kg丙酸睾酮能够恢复相关行为和氧化应激参数。2丙酸睾酮改善酒精处理大鼠氧化应激损伤。第二部分丙酸睾酮改善老年雄性大鼠黑质线粒体复合物I酶的活性目的:观察老年雄性大鼠脑内线粒体电子传递链酶活性的改变,补充丙酸睾酮是否能够改善电子传递链的酶活性及相关mt DNA编码亚基的表达。方法:将雄性SD大鼠分为成年组(6Mon)、老年组(24Mon)和老年TP组(24Mon-TP)。采用流式细胞技术观察大鼠黑质和海马线粒体膜电位的变化;以生物化学方法检测大鼠黑质和海马线粒体氧化应激参数;以紫外分光光度法分析线粒体电子传递链的酶活性;应用实时荧光定量PCR(q PCR)及Western blot方法分析大鼠黑质mt DNA编码复合物I亚基的表达。结果:1线粒体膜电位:24Mon组大鼠黑质和海马的Rh123荧光强度值与6Mon组相比均显著减少(P<0.01);TP处理使24Mon大鼠SN(P<0.01)和HIP(P<0.05)的Rh123荧光强度值增加,但未恢复到6Mon组水平(P<0.01)。2线粒体氧化应激参数:24Mon组大鼠SN和HIP线粒体的Mn-SOD、GSH-PX活力及GSH的量与6Mon组相比均显著减少(P<0.01),MDA和LPO的量与6Mon组相比均显著增加(P<0.01)。TP处理使24Mon大鼠SN和HIP线粒体的Mn-SOD、GSH-PX活力及GSH的量增加,MDA和LPO的量减少,未恢复到6Mon组水平(P<0.01)。3线粒体复合物活性:6Mon、24Mon和24Mon-TP三组大鼠间SN线粒体复合物II、III、IV酶活性和HIP线粒体复合物I、II、III、IV酶活性无显著性差异。24Mon组大鼠SN线粒体复合物I酶活性较6Mon组降低28.94%(P<0.01);24Mon-TP组大鼠黑质线粒体复合物I酶活性较24Mon组增加19.89%(P<0.01),未恢复到Sham组水平(P<0.05)。4黑质mt DNA编码复合物I亚基的m RNA:6Mon、24Mon和24Mon-TP三组大鼠mt DNA编码复合物I亚基ND2、ND3、ND4L、ND5和ND6的m RNA表达无显著性差异。与6Mon组相比,24Mon组大鼠ND1和ND4 m RNA的相对表达分别降低了27.85%和29.27%(P<0.01);TP处理使24Mon大鼠ND1和ND4的m RNA表达比24Mon组大鼠分别升高了21.05%和22.41%(P<0.01),未恢复至6Mon组水平(P<0.01)。5黑质ND1和ND4蛋白表达:24Mon组大鼠ND1、ND4蛋白的相对表达量比6Mon组分别降低了40.68%、33.33%(P<0.01);24Mon-TP组ND1、ND4蛋白的相对表达量比24Mon组大鼠分别升高了34.29%、25%(P<0.01),未恢复至6Mon组水平(P<0.01)。6血清睾酮:24Mon组大鼠血清睾酮浓度与6Mon组相比显著降低(P<0.01)。TP处理使24Mon大鼠血清睾酮浓度恢复到了6Mon组水平。小结:1老年大鼠黑质和海马存在线粒体的功能障碍;补充TP改善黑质和海马的线粒体功能。2老年大鼠脑内线粒体电子传递链呈现脑区域特异性酶活性的改变;黑质线粒体复合物I酶活性降低;补充TP改善其酶活性。3老年大鼠黑质线粒体复合物I的亚基ND1、ND4表达减少,补充TP提高其表达。第三部分雄激素参与大鼠黑质线粒体复合物I酶活性的调节目的:观察雄激素是否参与大鼠脑内线粒体电子传递链酶活性的调节。方法:选用成年健康的雄性SD大鼠,分为假手术组(Sham)、去势组(GDX)和去势TP组(GDX-TP);采用流式细胞技术观察大鼠黑质和海马线粒体膜电位的变化;以紫外分光光度法分析线粒体电子传递链的酶活性;应用q PCR及Western blot方法分析大鼠黑质mt DNA编码复合物I亚基的表达。结果:1线粒体膜电位:GDX组大鼠黑质和海马的Rh123荧光强度值与Sham组相比均显著减少(P<0.01);TP处理使GDX大鼠黑质和海马的Rh123荧光强度值恢复到了Sham组水平。2线粒体复合物活性:Sham、GDX和GDX-TP三组大鼠间黑质线粒体复合物II、III、IV酶活性和海马线粒体复合物I、II、III、IV酶活性无显著性差异。GDX组大鼠黑质线粒体复合物I酶活性较Sham组降低24.32%(P<0.01);GDX-TP组大鼠黑质线粒体复合物I酶活性较GDX组增加38.82%(P<0.01),恢复到Sham组水平。3黑质mt DNA编码复合物I亚基的m RNA:Sham、GDX和GDX-TP三组大鼠mt DNA编码的复合物I亚基ND2、ND3、ND4L、ND5和ND6无显著性差异。与Sham组相比,GDX组大鼠的ND1 m RNA和ND4 m RNA的相对表达量分别降低了8.97%和14.11%(P<0.01);TP处理使GDX大鼠降低的ND1 m RNA和ND4 m RNA表达恢复至Sham组水平;与GDX组大鼠相比分别升高了9.86%和15.07%(P<0.01)。4黑质ND1和ND4蛋白表达:与Sham组相比,GDX组大鼠ND1、ND4的相对表达量分别降低了26.23%、26.47%(P<0.01);GDX-TP组大鼠ND1、ND4的相对表达量比GDX大鼠分别升高了33.33%、30%(P<0.01),恢复至Sham组水平。小结:1成年雄性大鼠去势特异性地降低黑质线粒体复合物I的酶活性,减少其亚基ND1、ND4的表达。2补充雄激素恢复去势大鼠黑质线粒体复合物I的酶活性以及其亚基ND1、ND4的表达。3线粒体亚基ND1、ND4的表达为雄激素依赖。