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研究背景缺血性脑卒中（ischemia stroke,IS）是目前我国发病率较高的疾病,2013年流行病学调查显示,我国卒中年标准化患病率1114.8/10万、发病率246.8/10万、病死率为114.8/10万[1]。近年来,欧美国家卒中发病率和病死率逐渐下降,而我国的发病率,却以每年8.7%的速度增长,显著高于世界卒中总体年发病率[2],脑卒中已成为我国公民的第一位死亡原因,最新数据显示,新发患者中,缺血性卒中占总体的70%[3]。急性缺血性卒中的救治水平关系到我国居民的健康,其高发病率、高致残率,高病死率,给患者和家庭带来巨大的痛苦,对社会造成沉重的经济负担[4]。近年来,虽然投入大量研究了解缺血性脑卒中机制,但对于缺血性脑卒中的治疗,仍缺乏明确有效的治疗措施。研究表明,IS后神经元不仅发生凋亡与坏死,还可发生自噬,但其在IS后神经功能障碍中的作用尚存在争议。而一类线粒体去乙酰化酶—SIRT3在神经元损伤后表达增高,其可能参与能量代谢、细胞凋亡、生存信号通路的关键环节。以往研究表明SIRT3在老年性心肌反应性肥大、肿瘤及衰老等相关疾病中发挥保护作用。然而,SIRT3在缺血性脑卒中如何发挥作用及其机制,目前尚未得到明确肯定。实验目的1.观察不同时长氧糖剥夺再灌注（Oxygen-glucose deprivation-reperfusion,OGD/R）对神经元结构和功能损伤的影响;2.观察神经元自噬相关分子LC3、P62、PINK1、Parkin和Cleaved caspase-3的时空变化规律;3.观察神经元自噬和SIRT3蛋白的相关性;4.探讨自噬水平对OGD/R损伤后对神经元活性和凋亡的影响;5.探讨SIRT3分子在OGD/R损伤后神经元自噬与损伤的关系和作用,为脑缺血损伤治疗提供新的切入点。实验方法1.通过原代小鼠皮层神经元离体培养,利用缺氧孵箱模拟缺氧环境,建立神经元氧糖剥夺再灌注离体损伤模型,模拟缺血性脑卒中再灌注损伤。2.光镜下观察小鼠皮层神经元OGD/R损伤的形态学改变;采用细胞增殖-毒性检测试剂（Cell Counting Kit-8,CCK-8）和乳酸脱氢酶（Lacatate dehydrogenase,LDH）试剂盒检测细胞活力,评价OGD/R后神经元损伤。3.蛋白免疫印迹技术（Western blot）和免疫荧光的方法检测OGD/R后自噬、线粒体自噬、凋亡相关分子和SIRT3蛋白的时空表达。4.采用自噬激动剂RAPA和自噬抑制剂3-MA,调节OGD/R处理后自噬水平,观察自噬对神经元的影响作用。5.采用慢病毒转染技术上调SIRT3的表达,建立OGD/R损伤模型,观察损伤后形态学改变,LDH释放检测和CCK-8活力检测,评价神经元损伤情况;应用原位末端标记（terminal Dutp nick end labelling,TUNEL）方法检测小鼠皮层神经元凋亡改变。6.采用蛋白免疫印迹技术和免疫荧光的方法检测过表达SIRT3小鼠皮层神经元OGD/R损伤后自噬、线粒体自噬、凋亡相关分子等相关蛋白的水平改变。7.采用自噬激动剂（RAPA）和自噬抑制剂（3-MA）,调节自噬水平,观察OGD/R损伤后自噬对过SIRT3小鼠皮层神经元影响作用。实验结果第一部分研究发现:（1）小鼠皮层神经元对缺血、缺氧敏感,OGD/R可明显损害正常神经元形态,随着OGD/R损伤时间延长,形态改变越明显;与正常对照组比较,LDH释放量呈进行性升高,细胞活性呈进展性下降趋势,各组差异性显著（P<0.01）。表明OGD/R损伤神经元活性与时间呈正相关;（2）蛋白免疫印迹发现,与正常对照组相比,LC3-II在OGD4h时表达最高,P62在OGD2h增高,OGD4h下降,表明自噬水平显著增高（P<0.05）,PINK1在OGD4h时表达最高,Parkin蛋白在OGD/R损伤后整体表达下降（P<0.05）;Cleaved caspase-3表达在损伤开始即出现明显增高,在OGD4h以后出现平台期,但表达仍进一步增高（P<0.01）。SIRT3表达与LC3-II、PINK1相似,在OGD/R处理后表达整体上调,并于OGD 4h达峰值后逐渐下降,表达呈类抛物线状;（3）通过自噬抑制剂（3-MA）和自噬激动剂（RAPA）调解自噬水平,CCK-8检测和Western blot检测结果提示,与OGD4h组相比,抑制自噬,细胞活力下降,凋亡表达增加;提高自噬,细胞活力增高,凋亡表达减少。本部分研究表明:OGD/R损伤可激活神经元自噬,在4h是自噬水平达到最高峰,SIRT3可能通过参与自噬过程,减少细胞凋亡。在早期,适度上调自噬在一定程度上可以减少细胞凋亡,发挥保护神经元的作用。第二部分研究发现:（1）过表达SIRT3可明显改善OGD/R处理后小鼠皮层神经元损伤形态,增强神经元活性,减少细胞凋亡率;（2）蛋白免疫印迹和免疫荧光结果发现,与OGD4h组比较,过表达SIRT3后OGD/R损伤小鼠神经元LC3-Ⅱ、PINK1表达增高（P<0.05）,Cleaved caspase-3表达下降（P<0.05）;进一步免疫荧光检测结果印证了,SIRT3表达上调,LC3-Ⅱ点状荧光增强,自噬增加,Caspase-3表达减少,细胞凋亡减少;（3）CCK-8检测和Western blot检测结果提示,通过3-MA抑制自噬和RAPA上调自噬表明,抑制自噬,过表达SIRT3神经元自噬显著降低,细胞活性降低,损伤加重,凋亡减少;提高自噬,过表达SIRT3小鼠神经元自噬增强,细胞活性增高,凋亡减少。本部分研究表明:过表达SIRT3可明显改善OGD/R处理后的神经元损伤,减少细胞凋亡,发挥神经元保护作用;抑制自噬,可以抵消SIRT3保护神经元作用,提高自噬,可以增加SIRT3对OGD/R损伤的拮抗作用。实验结论本研究证实:OGD/R损伤可激活神经元自噬,OGD4h是自噬水平的最高峰。在4h以内,适度上调自噬在一定程度上可以减少细胞凋亡,发挥保护神经元的作用;过表达SIRT3小鼠皮层神经元抵抗OGD/R损伤能力提高,细胞活性增强;SIRT3可能通过调控自噬发生,抑制神经元凋亡,参与了拮抗神经元缺血损伤,发挥神经元保护作用。