目的食管癌是胃肠道中最常见的恶性肿瘤之一。在中国,食管癌被认为是第四大最致命的癌症,对人类的身心健康存在着严重的威胁。食管癌的病理类型主要有两种,即食管鳞癌和食管腺癌。在我国,食管鳞癌是最主要的食管癌类型,大约占90%以上。食管鳞癌的发生以及发展是一个长期复杂多变的过程。与其它恶性肿瘤一样,食管鳞癌的发生是由多种基因、多种因素相互作用的结果,而且其发病机制也是一个多阶段的发展过程,但其分子机制尚不清楚,在诊断和治疗上也缺乏有效的手段。随着肿瘤分子靶向治疗的不断进展,深入研究食管鳞癌的发病机制,以及寻找新的肿瘤治疗靶标与标志物将具有非常重要的意义。信号转导与转录激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)是Fu等人在1992年研究干扰素诱导基因转录时首次鉴定的一个蛋白家族。STAT蛋白家族成员,参与了各种肿瘤细胞的发生发展过程,包括细胞周期进展、血管生成、细胞凋亡、侵袭、转移和免疫逃避。目前已发现STAT家族存在7个成员,包括STATl、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6。作为STAT蛋白的家族成员之一,在人体中STAT3编码基因定位于第12号染色体上,是于1994年作为IL-6信号传递中的急性期反应因子而被纯化的。STAT3广泛地存在于不同类型的细胞和组织中,最初发现STAT3与肿瘤的关系是在v-Src转染的细胞系中发现了STAT3信号通路的激活,活化的STAT3蛋白突变体能转化培养的成纤维细胞,最终使小鼠致癌;而阻断STAT3信号后,成纤维细胞的转化则受到抑制。在多发性骨髓瘤和头颈部肿瘤细胞的生长过程中发现了激活的STAT3信号,首次揭示了STAT3与人类恶性肿瘤的发生密切相关。己有较多文献报道了STAT3在头颈部肿瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌以及胃癌等多种恶性肿瘤中存在异常的表达,并参与了肿瘤的发生和发展。STAT3在多种人体肿瘤中存在异常的表达,而阻断STAT3信号通路能够抑制肿瘤细胞的增殖,并诱导肿瘤细胞凋亡。随着对STAT3信号通路研究的不断深入,STAT3信号通路在肿瘤的发生及发展过程中所扮演的角色越来越受到重视,以STAT3为靶点的治疗策略有望为某些恶性肿瘤的治疗开辟出一条新的途径。本文以小分子抑制剂stattic作为抑制STAT3磷酸化的药物,以研究STAT3在食管鳞癌的发生及发展中的作用。第一部分阻断STAT3信号对食管鳞癌细胞增殖和抗凋亡的影响方法1.利用Western blotting检测多种不同来源的食管鳞癌细胞株中p-STAT3的激活情况。2.利用细胞毒性实验检测不同浓度(DMSO、1、3、10和30μM)的stattic在24h和48h对食管鳞癌细胞的毒性作用,并筛选出用于细胞增殖实验的stattic浓度。3.根据细胞毒性实验的结果选取用于细胞增殖实验的最大药物浓度,设置细胞增殖实验的stattic浓度(DMSO、1、2、3和4μM),检测不同浓度的stattic在不同时间点(0、24、48、72和96h)对食管鳞癌细胞的增殖抑制作用,并观察其抑制作用与STAT3表达是否相关。4.利用软琼脂克隆形成实验检测不同浓度stattic(DMSO、1、2、3和4μM)对食管鳞癌细胞的克隆形成能力的影响。5.利用Western blotting检测不同浓度(DMSO、5、10和20μM)stattic对食管鳞癌细胞中的STAT3及相关基因表达的影响。6.利用Western blotting检测不同浓度(DMSO、5、10和20μM)stattic+IL-6(30ng/ml)对食管鳞癌细胞中的STAT3活化及阻断情况的影响。7.利用Annexin V、PI和Hoechst合染以及DAPI染色来检测不同浓度的stattic(DMSO、1、2、3和4μM)对食管鳞癌细胞凋亡及周期的影响。结果1.在多例食管鳞癌细胞系中,STAT3均呈现出不同程度的表达,但是其磷酸化水平存在差异,Eca109、EC9706、TE1、TE13和KYSE450中都呈现出STAT3异常的激活状态,而EC1、KYSE70和KYSE140中无STAT3的磷酸化。2.stattic对食管鳞癌细胞的毒性作用很明显,并抑制STAT3组成型激活的食管鳞癌细胞的增殖,且这种抑制能力随着stattic的药物浓度增加而增强。3.在无毒性的作用浓度下,stattic不能抑制无STAT3组成型激活的食管鳞癌细胞的增殖。4.软琼脂克隆形成实验结果显示,在具有STAT3组成型激活的食管鳞癌细胞中,随着stattic药物浓度的增加,细胞克隆数量减少。5.stattic可抑制STAT3的磷酸化及Cox2的表达,上调NOS和Pentraxin 3的表达,这种调节作用显现出了药物浓度依赖的趋势。6.IL-6可激活食管鳞癌细胞中STAT3,而stattic可终止这种激活作用,且这种调节作用与stattic的作用浓度有依赖关系。7.Stattic可以促进具有STAT3组成型激活的食管鳞癌细胞(EC9706)的凋亡,并将其细胞周期阻断在S期。第二部分阻断STAT3信号在食管鳞癌PDX模型移植瘤小鼠中的治疗作用方法1.利用Western blotting检测多例食管鳞癌组织中STAT3的激活状况。2.筛选出STAT3高磷酸化的食管鳞癌组织(EG30),用SCID小鼠PDX模型检测STAT3抑制剂stattic和化疗药物5-FU的抗癌效果。3.采用Western blotting检测stattic和5-FU单独或联合治疗对肿瘤组织中STAT3信号通路及i NOS、Cox2和Pentraxin-3表达的影响。4.通过免疫组织化学检测stattic和5-FU单独或联合治疗对肿瘤组织中目标蛋白p-STAT3、Cox2、Pentraxin-3和caspase-3表达的影响。5.利用TUNEL试剂盒检测stattic和5-FU单独或联合治疗后,肿瘤组织中细胞的凋亡情况。结果1.在STAT3组成型激活的食管鳞癌异种移植瘤小鼠中,stattic可显著抑制小鼠皮下肿瘤的生长,而化疗药物5-FU呈现出了耐药性,疗效并不显著;但当5-FU联合stattic时,与stattic单独治疗组相比,其对肿瘤生长的抑制作用更强。2.在肿瘤组织中,stattic治疗组中STAT3和Cox2的激活水平下降,但i NOS和Pentraxin 3的表达增强。3.免疫组化结果显示,stattic可以下调STAT3的磷酸化水平及Cox2的表达,并促进NOS和Pentraxin 3的表达。4.TUNEL结果表明,在STAT3组成型激活的食管鳞癌中,stattic可以显著诱导肿瘤细胞的凋亡,而5-FU联合stattic时会导致更为显著的细胞凋亡。结论1.在食管鳞癌细胞系及肿瘤组织中普遍存在STAT3信号通路的异常激活,但是其磷酸化水平存在差异。2.小分子抑制剂stattic可以抑制组成型活化及因IL-6诱导的STAT3的激活,并导致肿瘤细胞的增殖及克隆形成受到抑制,促进细胞凋亡,这与Cox2表达水平的下降以及i NOS和Pentraxin-3表达水平的升高密切相关。3.在SCID小鼠PDX模型体内研究中,stattic可以有效地抑制STAT3组成型激活食管肿瘤的生长,并增加5-FU的药物敏感性,促进食管鳞癌细胞凋亡。