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目的:Pyroxd2是通过酵母双杂交筛选出的与乙肝病毒X蛋白具有相互作用的蛋白。已有实验证实Pyroxd2在肿瘤细胞中表达量低于正常细胞,并且在癌组织中表达量也低于癌旁组织。过表达Pyroxd2可诱导肝癌细胞凋亡,抑制小鼠肝肿瘤发生,但具体功能机制尚不清晰。前期课题组证实Pyroxd2定位于线粒体,但生物信息学分析显示Pyroxd2并没有典型的线粒体定位信号肽。作为一个功能未知蛋白,为了将来深入探索Pyroxd2具体生物学功能,本课题拟对Pyroxd2在线粒体中的亚定位,Pyroxd2线粒体输入的分子机制以及介导Pyroxd2进入线粒体的关键氨基酸序列进行分析和研究。方法:通过细胞免疫荧光,Western blot,CO-IP,BN-PAGE等方法研究了Pyroxd2线粒体亚定位。通过对Pyroxd2进行氨基酸序列删除突变,结合细胞免疫荧光以及细胞组分Western blot实验分析了Pyroxd2进入线粒体的关键氨基酸序列。通过RNA干扰构建一系列敲低细胞系研究了Pyroxd2蛋白在线粒体输入的相关分子机制。结果:CO-IP实验进一步证实Pyroxd2与线粒体呼吸链复合物Ⅳ组分之一的COX5B互作,通过线粒体组分分析确认Pyroxd2仅存在于线粒体内膜和基质组分中,BN-PAGE结果显示Pyroxd2存在于线粒体呼吸链复合物Ⅳ(complexⅣ)上,表明Pyroxd2是一个存在于线粒体呼吸链复合物IV并与COX5B互作的蛋白;shRNA干扰线粒体外膜通道蛋白Tom40和线粒体内膜通道蛋白Tim23的表达均导致Pyroxd2-EYFP融合蛋白无法与线粒体标志蛋白COX4共定位,同时,western blot也检测到Pyroxd2-3×flag融合蛋白主要存在于细胞质基质组分中,然而,shRNA干扰与线粒体膜间隙定位相关蛋白Mia40的表达并不影响Pyroxd2-EYFP融合蛋白与COX4共定位,western blot检测Pyroxd2-3×flag融合蛋白也主要存在于线粒体组分中。这些结果表明Pyroxd2线粒体输入依赖于Tom40和Tim23,而与Mia40无关,提示Pyroxd2依赖线粒体外膜转位酶TOM复合物与内膜转位酶TIM23复合物输入线粒体内膜和基质组分中,而不定位于外膜和膜间隙;序列删除突变结果发现仅Pyroxd2的101-400aa、101-200aa、201-300aa、151-200aa、201-230aa和151-230aa多肽序列分别与EYFP构成的融合蛋白能定位与线粒体,同时,删除151-230aa系列的Pyroxd2与EYFP构成的融合蛋白不能定位于线粒体,结果表明151-230aa是介导Pyroxd2蛋白定位于线粒体的关键序列。