枸杞多糖对化学性肝细胞损伤的保护作用及机制研究

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目的:探讨枸杞多糖(LBPs)对乙醇和抗结核药物诱导的化学性肝细胞损伤的保护作用及其机制,为外源性化学物的肝毒性防护和LBPs的开发利用提供实验及理论依据。
  方法:
  1.LBPs对乙醇和抗结核药物诱导肝细胞损伤的保护作用。选用人正常肝细胞(L-02细胞)进行实验。采用MTT法考察LBPs对L-02细胞活力的影响,筛选乙醇和抗结核药物损伤浓度以建立两种化学性肝细胞损伤模型。设立对照组、乙醇损伤组、LBPs保护组和水飞蓟素阳性对照组用于研究LBPs对乙醇诱导肝细胞损伤的保护作用;设立对照组、异烟肼(INH)+利福平(RFP)损伤组、LBPs保护组和水飞蓟素阳性对照组用于研究LBPs对抗结核药物诱导肝细胞损伤的保护作用。(1)MTT法测定各组L-02细胞活力,选用细胞活力最高的分子量范围LBPs用于后续研究;(2)分光光度法测定各组L-02细胞培养液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)的活力。
  2.LBPs对乙醇和抗结核药物诱导肝细胞损伤的保护作用机制。(1)2,7-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)法测定各组L-02细胞内活性氧(ROS)水平;(2)分光光度法测定各组L-02细胞裂解液中过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力和谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量;(3)AnnexinⅤ-FITC/PI双染法测定各组L-02细胞凋亡率;(4)蛋白免疫印迹(Western blot)法测定各组L-02细胞裂解液中相关蛋白表达水平,包括Nrf2信号通路中Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC,JNK信号通路中JNK、p-JNK,线粒体凋亡通路中Bcl-2、Bax、cytc、caspase-9、caspase-3等蛋白的表达水平。
  结果:
  1.LBPs3对乙醇和抗结核药物诱导肝细胞损伤的保护作用。LBPs在0~200μg/mL间对L-02细胞增殖无抑制或促进作用。
  以5%乙醇损伤L-02细胞4h建立乙醇诱导肝细胞损伤模型。(1)不同浓度LBPs3组的细胞活力均高于其他LBPs组,选取12.5、25、100μg/mLLBPs3(低、中、高LBPs3组)研究其对乙醇诱导肝细胞损伤的保护作用;(2)中、高LBPs3组细胞培养液中ALT、AST、LDH活力较乙醇损伤组降低(P<0.05)。
  以100+200μg/mLINH+RFP合用损伤L-02细胞24h建立抗结核药物诱导肝细胞损伤模型。(1)不同浓度LBPs3组的细胞活力均高于其他LBPs组,选取12.5、25、50μg/mLLBPs3(低、中、高LBPs3组)研究其对抗结核药物诱导肝细胞损伤的保护作用;(2)低、中、高LBPs3组细胞培养液中ALT、AST、LDH活力较INH+RFP损伤组降低(P<0.05)。
  2.LBPs3对乙醇和抗结核药物诱导肝细胞损伤的保护作用机制。
  LBPs3对乙醇诱导肝细胞损伤的保护作用机制。与乙醇损伤组相比:(1)中、高LBPs3组细胞内ROS水平降低(P<0.05);(2)低、中、高LBPs3组CAT、SOD和GSH-Px活力升高,中、高LBPs3组GSH含量升高,中、高LBPs3组MDA含量降低(P<0.05);(3)低、中、高LBPs3组Nrf2蛋白核转位水平和HO-1、NQO1、GCLC蛋白表达水平升高(P<0.05);(4)低、中、高LBPs3组细胞凋亡率下降(P<0.05);(5)中、高LBPs3组JNK蛋白磷酸化水平降低(P<0.05);中、高LBPs3组caspase-3蛋白表达水平降低,低、中、高LBPs3组Bax、cytc和caspase-9蛋白表达水平降低,中、高LBPs3组Bcl-2蛋白表达水平升高,低、中、高LBPs3组Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05)。
  LBPs3对抗结核药物诱导肝细胞损伤的保护作用机制。与INH+RFP损伤组相比:(1)低、中、高LBPs3组细胞内ROS水平降低(P<0.05);(2)中、高LBPs3组的CAT、SOD活力和GSH含量升高,低、中、高LBPs3组的GSH-Px活力升高,低、中、高LBPs3组的MDA含量降低(P<0.05);(3)低、中、高LBPs3组Nrf2蛋白核转位水平和HO-1蛋白表达水平升高,高LBPs3组NQO1、GCLC蛋白表达水平升高(P<0.05);(4)低、中、高LBPs3组细胞凋亡率下降(P<0.05);(5)低、中、高LBPs3组JNK蛋白磷酸化水平降低(P<0.05);低、中、高LBPs3组Bax蛋白表达水平降低,中、高LBPs3组caspase-3蛋白表达水平降低,低、中、高LBPs3组Bcl-2蛋白表达水平和Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05)。
  结论:(1)LBPs3对乙醇和抗结核药物诱导的化学性肝细胞损伤具有保护作用;(2)LBPs3可通过抑制乙醇和抗结核药物诱导的肝细胞氧化应激、激活Nrf2信号通路、抑制JNK通路和线粒体介导的肝细胞凋亡而发挥其保护作用。
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