目的：从角膜内皮细胞的分离、培养基的选择、细胞培养方式及种属来源方面进行筛选和优化，寻找最佳的角膜内皮细胞体外培养模型的建立方法，为以后角膜内皮细胞在体外的长期有效培养提供实验依据。方法：本实验分为四个部分，通过对四个部分结果的综合分析得出角膜内皮细胞的体外培养模型。①剥离带后弹力层的兔角膜内皮片，用双酶消化法（胰蛋白酶和胶原酶）及组织片法对角膜内皮细胞进行分离培养，倒置显微镜下观察角膜内皮细胞生长情况，经观察分析得出的细胞数量多、污染少的较好分离方法，为后续阶段采用。②选取F99培养基、DMEM/F12培养基、KSFM培养基三种培养基分别对兔角膜内皮细胞进行原代及传代培养，倒置显微镜下观察角膜内皮细胞生长情况。经分析讨论得出细胞增殖快、细胞形态好的培养基，后续阶段沿用。③采用消化法、与3T3细胞共培养法、细胞克隆培养法对兔角膜内皮细胞进行培养，倒置显微镜下观察角膜内皮细胞生长情况，得出细胞传代快、传代较久的培养方法。④对人、猪、小鼠、兔角膜内皮细胞进行体外培养，并进行细胞形态学观察及免疫荧光鉴定，选出细胞形态维持好、传代时间长的一种角膜内皮细胞。结果：①经双酶消化法培养20天后，兔角膜内皮细胞呈多边形或多角星形，细胞形成单层，未见长梭形的兔角膜基质细胞。组织片法培养2周后可见及部分呈长梭型放射状生长的兔角膜基质细胞生长其中。②F99培养基中培养的原代兔角膜内皮细胞在第25天融合成单层，细胞呈多角形、细胞数量多，在三种培养基中细胞形态最规则，细胞数目最多，融合时间最快。第2次传代的第4天，F99培养基培养的兔角膜内皮细胞数最多，且形态规则。③消化法中经消化后细胞贴附快，细胞形态好，消化传代后，细胞培养4-5天即形成新的单层细胞，在传至第10代后仍维持较好的生长态势。而兔角膜内皮细胞与3T3细胞共培养后，第5天可见明显的兔角膜内皮细胞团，细胞呈密集的“鹅卵石”样形态。培养至第14天细胞团内细胞数明显减少，剩余的细胞呈细胞核体积增大、颜色加深的衰老迹象。克隆培养法中角膜内皮细胞在培养7天后形成克隆球，扩大培养2代后细胞体积变大，增殖缓慢。④小鼠角膜内皮细胞在体外传代26代后仍维持较好的细胞形态。兔角膜内皮细胞在体外培养26代后增殖减缓，细胞呈长梭形改变，经免疫荧光鉴定，此时兔角膜内皮细胞已向间质细胞分化。人角膜内皮细胞在体外培养从传代的第4代起细胞不再呈“铺路石”样，细胞出现体积增大等衰老状态；猪角膜内皮细胞在体外培养传代至第7代细胞停止增殖。结论：利用双酶消化法分离出小鼠角膜内皮细胞在F99培养基中进行消化法培养是角膜内皮细胞体外培养的良好模型。