癌症拥有复杂的致病机理,目前学术界和医学界对于癌症还没有提出有效的治愈手段,但人们期待攻克癌症的热情和迫切从未减退。肺癌是全球最常见的癌症死亡原因之一。在肺癌的治疗过程中,放疗和化疗是肺癌的主要治疗手段。虽然放疗和化疗在肿瘤中有一定的效果,但单独在肺鳞癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)和肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)中应用的效果却较差,临床中在对肺癌患者进行治疗时,一般采用放化疗联合治疗的方式。然而,放疗和化疗不仅会杀灭肿瘤细胞,还会杀害患者本身的健康细胞。因此,靶向治疗就显得尤为重要。近年来,靶向治疗已经成为了癌症治疗的热点,且有的靶向药物已经取得了较好的治疗效果。在不同类型的肺癌中,LUSC和LUAD中的突变点相对其他肿瘤较多,但是两种肿瘤中的异常分子并不相同,更为重要的是LUAD和LUSC在肿瘤发生发展的遗传和表观学上也具有显著差异。目前LUAD中的很多相关性的关键分子已经被广泛验证,这使得复发或不可切除的LUAD在治疗上有了很大的改善。相反,由于缺乏特定的驱动分子或突变,治疗LUSC的靶向治疗的方案很少。因此,寻找在LUSC的发生和发展中有效的治疗靶标就显的尤为重要。长链非编码RNA(longnon-coding RNA,lncRNA)是一种长度超过200个核苷酸的非编码RNA。LncRNA是调控各种细胞生物过程的重要基因,包括了进行基因组印记、X染色体沉默、染色质修饰、核内运输、转录激活及转录干扰等过程。近年来,研究发现很多lncRNA可以异常表达于人类恶性肿瘤中,并可以作为癌基因或者抑癌基因调控不同肿瘤的生物学功能。在肺癌中关于lncRNA的研究也已有很多,大量研究表明,lncRNA在肺癌中可以发挥非常重要的作用,并可以与肺癌的诊断及预后有关,敲除或者过表达肺癌细胞中的某个lncRNA后,可以影响肺癌细胞的增殖、侵袭、迁移、凋亡及周期,这将为肺癌的靶向治疗提供一定的实验依据。随着大数据时代的来临,在个体化医疗的基础上,结合生物信息、大数据及基因测序技术交叉结合而发展起来了一种新型模式,即精准医学。精准医学首先通过手术对患者进行治疗和分析,精准的找到患者患病的原因,并进一步发现治疗可行的靶点。也可以对同一种疾病在发生的不同时期进行分析,进而个性化精准治疗的目的,以提高患者疾病的诊治效率。本研究中,我们收集了 3份新鲜LUSC组织标本及对应癌旁组织标本,并进行lncRNA芯片制备。通过充分利用LUSC测序数据及lncRNA芯片数据资源,将差异lncRNA取交集后发现共有12个差异下调表达lncRNA(CYP2B7P、CHIAP2、SFTA1P、MIR99AHG、HLA-F-AS1、SIGLEC17P、PGM5-AS1、ECEL1P2、LINC00968、FENDRR、SIGLEC16 及 LHFPL3-AS2)和1个上调表达lncRNA(BBOX1-AS1)。通过对13个差异lncRNA进行研究现状分析发现,CHIAP2、SFTA1P、MIR99AHG、LINC00968 及FENDRR在LUSC中已有研究,关于LINC00968及FENDRR研究较丰富。而 PGM5-AS1、HLA-F-AS1、LHFPL3-AS2、SIGLEC17P、SIGLEC16、ECEL1P2、CYP2B7P及BBOX1-AS1在LUSC中尚未有研究,在其他肿瘤中的研究也较少。因此,我们首先随机选取3个lncRNA--PGM5-AS1、HLA-F-AS1和LHFPL3-AS2作为我们接下来进一步研究的目标lncRNA。本课题组的前期芯片研究表明PGM5-AS1、HLA-F-AS1和LHFPL3-AS2三个lncRNA在LUSC组织中表达有明显低于癌旁肺组织的趋势。而且通过LUSC测序数据也证明了三个lncRNA在LUSC中的低表达情况,但是PGM5-AS1、HLA-F-AS1和LHFPL3-AS2 三个 lncRNA 在LUSC 细胞中的表达与功能及可能的机制尚未有研究。本课题拟通过real time RT-qPCR检测三株LUSC细胞(NCI-H1703、NCI-H226和SK-MES-1)及人正常肺上皮细胞 BEAS-2B 中 PGM5-AS1、HLA-F-AS1 和 LHFPL3-AS2 的表达水平。并通过构建过表达慢病毒载体,转染NCI-H1703、NCI-H226和SK-MES-1三株LUSC细胞系,以获得稳定的过表达PGM5-AS1、HLA-F-AS1和LHFPL3-AS2的LUSC细胞,接下来通过CCK-8细胞活力检测实验、Celigo划痕实验、PI-FACS细胞周期检测实验、Annexin V-APC单染法流式细胞仪检测实验等体外实验检测过表达PGM5-AS1、HLA-F-AS1和LHFPL3-AS2后对LUSC细胞增殖、迁移、细胞周期及凋亡的影响。并通过MEM、Cbioportal 及 LUSC 原创芯片中的差异 mRNA 寻找 PGM5-AS1、HLA-F-AS1和LHFPL3-AS2的共表达基因,通过GO功能富集、KEGG信号通路及PPI蛋白互作关系分析进一步探讨三个lncRNA在LUSC细胞中的表达与功能及潜在机制。我们相信随着LUSC机制的进一步研究,以及新治疗靶点的发现,LUSC患者将会从中获益。第一章原发性LUSC组织中的长链非编码RNA及mRNA芯片筛选材料和方法1.3份新鲜LUSC组织标本及对应癌旁组织标本的收集2.对标本进行LUSC lncRNA及mRNA芯片的制备3.原发性LUSC组织芯片中的差异lncRNA及差异mRNA芯片的筛选。4.mRNA芯片结果进行GO功能富集、KEGG信号通路及PPI蛋白互作关系分析结果1.通过芯片测序数据发现LncRNA芯片中明显差异表达的LncRNA有1,564个,其中包括533个上调表达的lncRNA和1,031个下调表达的lncRNA。mRNA芯片中明显差异表达的mRNA有907个,其中包括412个上调表达的mRNA和495个下调表达的mRNA。2.通过对mRNA芯片结果进行GO功能富集及KEGG信号通路分析发现差异mRNA主要参与细胞信号传导、蛋白质代谢、蛋白质磷酸化、细胞粘附分子的结合、G蛋白偶联受体结合、钙离子及mRNA的结合等过程,并主要富集于肾上腺能信号通路、ECM受体相互作用通路、蛋白质代谢等信号通路。通过PPI蛋白互作分析发现,在蛋白互相作用关系网络中ACTB、ALB、ACTL7B、HDAC1、CPS1、MIB2、UBD、LM07、ADCY5、EIF4E和PAICS是核心基因。第二章基于测序数据的LUSC中lncRNAs的计算生物学分析材料和方法1.LUSC测序数据处理及LUSC中lncRNA芯片筛选2.差异lncRNA取交集并进一步筛选明显差异表达的lncRNA3.基于测序数据的LUSC中差异lncRNAs的表达水平检测4.差异lncRNAs的研究现状分析结果1.通过LUSC测序数据,我们发现LUSC中有5,964个差异表达的lncRNA,其中上调表达的差异lncRNA有1,924个,下调表达的差异lncRNA有4,040个。通过lncRNA芯片数据,我们发现LUSC芯片中有8,397个差异表达的lncRNA,其中上调表达的lncRNA有4,057个,下调表达的lncRNA有4,340个。2.通过对差异lncRNA取交集发现共有12个差异下调表达lncRNA(CYP2B7P、CHIAP2、SFTA1P、MIR99AHG、HLA-F-AS1、SIGLEC17P、PGM5-AS1、ECEL1P2、LINC00968、FENDRR、SIGLEC16 及 LHFPL3-AS2)和 1 个上调表达 lncRNA(BBOX1-AS1)。3.通过LUSC测序数据计算这些差异lncRNA的表达发现,13个差异表达lncRNA的表达趋势与芯片结果一致,即CYP2B7P、CHIAP2、SFTA1P、MIR99AHG、HLA-F-AS1、SIGLEC17P、PGM5-AS1、ECEL1P2、LINC00968、FENDRR、SIGLEC16 及 LHFPL3-AS2 在 LUSC 中的表达明显低于正常肺组织,而BBOX1-AS1在LUSC中的表达明显高于正常肺组织。4.通过对13个差异lncRNA进行研究现状分析发现,CHIAP2、SFTA1P、MIR99AHG、LINC00968 及 FENDRR 在 LUSC 中已有研究,关于LINC00968 及 FENDRR 的研究较丰富。而 PGM5-AS1、HLA-F-AS1、LHFPL3-AS2、SIGLEC17P、SIGLEC16、ECEL1P2、CYP2B 7P 及 BBOX1-AS1在LUSC中尚未有研究,其他肿瘤中的研究也较少。PGM5-AS1、HLA-F-AS1和LHFPL3-AS2被随机选取纳入我们接下来进一步研究的范围。第三章LncRNAPGM5-AS1在LUSC细胞中的临床意义、功能及潜在机制材料和方法1.lncRNAPGM5-AS1的表达情况及其与临床病理参数的关系2.PGM5-AS1在LUSC中的综合分析3.使用 real time RT-qPCR 检测三株 LUSC 细胞(NCI-H1703、NCI-H226和SK-MES-1)及人正常肺上皮细胞BEAS-2B中PGM5-AS1的表达水平。4.构建过表达慢病毒载体,转染NCI-H1703和SK-MES-1三株LUSC细胞系,以获得稳定的过表达PGM5-AS1细胞。进一步检测PGM5-AS1在LUSC细胞中的生物学功能。5.通过CCK-8细胞活力检测实验、Celigo划痕实验、PI-FACS细胞周期检测实验、Annexin V-APC单染法流式细胞仪检测实验等分别检测过表达PGM5-AS1后对LUSC细胞增殖、迁移、细胞周期及凋亡的影响6.通过MEM、Cbioportal及LUSC原创芯片中的差异mRNA寻找PGM5-AS1的共表达基因,并通过GO功能富集、KEGG信号通路及PPI蛋白互作关系分析初步探讨PGM5-AS1在LUSC中可能涉及的功能及作用机制。结果1.PGM5-AS1在LUSC组织中明显低表达,但仍需大样本的验证。2.通过 SMD(standard mean deviation)综合分析发现,SMD为-3.67(-4.02,-3.32),证实PGM5-AS1在LUSC中是低表达。通过综合诊断效能分析发现,PGM5-AS1 在 LUSC 中 SROC 为 0.97(0.95-0.98),证明PGM5-AS1有较好的诊断效能。3.细胞RT-qPCR实验表明PGM5-AS1在LUSC细胞中的表达明显低于正常肺上皮细胞。4.成功构建过表达PGM5-AS1慢病毒载体,并成功转染到LUSC细胞NCI-H1703和SK-MES-1中进行体外实验研究。5.体外实验表明,过表达LUSC细胞中的PGM5-AS1后,可以抑制LUSC细胞迁移,促进LUSC细胞的凋亡,并阻滞细胞周期于S期或者G2/M期。6.通过GO功能富集及KEGG信号通路分析发现,PGM5-AS1可能通过影响 LUSC 细胞 extracellular matrix、focal adhesion、cytoskeletal protein binding、growth factor binding 及 protein complex binding 等功能发挥作用。这些功能的实现可能通过 cGMP-PKG signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、Rap l signaling pathway、Hippo signaling pathway、Wnt signaling pathway及MAPK signaling pathway等通路,但具体的分子机制仍需要大量实验进行验证。第四章LncRNAHLA-F-AS1在LUSC细胞中的临床意义、功能及潜在机制材料和方法1.lncRNAHLA-F-AS1的表达情况及其与临床病理参数的关系2.HLA-F-AS1在LUSC中表达及诊断综合分析3.使用 real time RT-qPCR 检测三株 LUSC 细胞(NCI-H1703、NCI-H226和SK-MES-1)及人正常肺上皮细胞BEAS-2B中HLA-F-AS1的表达水平。4.构建过表达慢病毒载体,转染NCI-H1703和NCI-H226三株LUSC细胞系,以获得稳定的过表达HLA-F-AS1细胞。进一步检测PGM5-AS1在LUSC细胞中的生物学功能。5.通过CCK-8细胞活力检测实验、Celigo划痕实验分别检测过表达HLA-F-AS1后对LUSC细胞增殖及迁移的影响6.通过MEM、Cbioportal及LUSC原创芯片中的差异mRNA寻找HLA-F-AS1的共表达基因,并通过GO功能富集、KEGG信号通路及PPI蛋白互作关系分析初步探讨HLA-F-AS 1在LUSC中可能涉及的功能及作用机制。结果1.HLA-F-AS1在LUSC组织中明显低表达,但仍需大样本的验证。2.通过SMD综合分析发现,SMD为-0.42(-0.67,-0.78),证实HLA-F-AS1在LUSC中呈低表达状态。通过综合诊断效能分析发现,HLA-F-AS1 在LUSC 中 SROC 为 0.89(0.86-0.91),证明 HLA-F-AS1在 LUSC中有较好的诊断效能。3.细胞RT-qPCR实验表明HLA-F-AS1在LUSC细胞中的表达明显低于正常肺上皮细胞。4.成功构建过表达HLA-F-AS1慢病毒载体,并成功转染到LUSC细胞NCI-H1703和NCI-H226中进行体外实验研究。5.过表达LUSC细胞中的HLA-F-AS1后,可以明显抑制迁移。6.通过GO功能富集及KEGG信号通路分析发现,HLA-F-AS1可能通过影响 LUSC 细胞 regulation of cell activation、cell projection part、cytoskeletal protein bindin及phospholipase C activity等功能发挥作用。这些功能的实现可能通过Calcium signaling pathway通路,但具体的分子机制仍需要大量实验进行验证。第五章LncRNALHFPL3-AS2在LUSC细胞中的临床意义、功能及潜在机制材料和方法1.lncRNALHFPL3-AS2的表达情况及其与临床病理参数的关系2.LHFPL3-AS2在LUSC中表达及诊断综合分析3.使用 real time RT-qPCR 检测三株 LUSC 细胞(NCI-H1703、NCI-H226和SK-MES-1)及人正常肺上皮细胞BEAS-2B中LHFPL3-AS2的表达水平。4.构建过表达慢病毒载体,转染NCI-H1703和SK-MES-1三株LUSC细胞系,以获得稳定的过表达LHFPL3-AS2细胞。进一步检测LHFPL3-AS2在LUSC细胞中的生物学功能。5.通过CCK-8细胞活力检测实验、Celigo划痕实验分别检测过表达LHFPL3-AS2后对LUSC细胞增殖及迁移的影响6.通过MEM、Cbioportal及LUSC原创芯片中的差异mRNA寻找LHFPL3-AS2的共表达基因,并通过GO和KEGG富集分析及PPI相互作用关系分析初步探讨LHFPL3-AS2在LUSC中可能涉及的功能及作用机制。结果1.LHFPL3-AS2在LUSC组织中明显低表达,但仍需大样本的验证。2.通过SMD综合分析发现,SMD为-4.68(-5.08,-4.28),证实LHFPL3-AS2在LUSC中呈低表达状态。通过诊断性分析发现,LHFPL3-AS2在 LUSC 中 SROC 为 0.94(0.91-0.95),证明 LHFPL3-AS2 在 LUSC 中有较好的诊断效能。3.细胞RT-qPCR实验表明LHFPL3-AS2在LUSC细胞中的表达明显高于正常肺上皮细胞。4.成功构建过表达LHFPL3-AS2慢病毒载体,并成功转染到LUSC细胞NCI-H1703和SK-MES-1中进行体外实验研究。5.体外实验表明,过表达LUSC细胞中的LHFPL3-AS2后,可以明显促进LUSC NCI-H1703细胞的增殖能力,同时抑制LUSC细胞NCI-H1703和SK-MES-1的迁移能力。6.通过GO和KEGG富集分析发现,LHFPL3-AS2可能通过影响LUSC细胞的 transmembrane transport、plasma membrane part、igated channel 和activity voltage-gated cation channel activity 等功能发挥作用。这些功能的实现可能通过 Calcium signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway 及 GnRH signaling pathway等通路,但具体的分子机制仍需要大量实验进行验证。结论1.结合课题组前期研究结果,PGM5-AS1、HLA-F-AS1和LHFPL3-AS2均是LUSC中明显差异表达的lncRNA。2.PGM5-AS1在LUSC中是一个抑癌基因,在组织及细胞中均为低表达状态,过表达PGM5-AS1在LUSC细胞中可以抑制迁移,促进凋亡,并阻滞细胞周期于S期或者G2/M期。3.HLA-F-AS1在LUSC中是一个抑癌基因,在LUSC组织及细胞中均为低表达状态,过表达HLA-F-AS1在LUSC细胞中可以明显抑制迁移。4.LHFPL3-AS2在LUSC组织及细胞中表达趋势相反,表现出一定的差异性,且在不同细胞中也表现出功能的差异性。5.通过GO功能富集及KEGG信号通路分析初步探讨了 PGM5-AS1、HLA-F-AS1和LHFPL3-AS2在LUSC中可能的分子功能及机制,但仍需进一步实验证实,对三个lncRNA的研究有望为肺癌的诊断、治疗及预后判断等提供新思路。