【摘 要】
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背景:乳腺癌是常见的女性恶性肿瘤,患病风险呈不断上升趋势。尽管对乳腺癌的诊疗取得较大进步,但其总生存期仍较短。生物信息学是近年来新兴学科,通过利用多学科结合技术揭示与乳腺癌基因层面发病机制,鉴定驱动基因,可为乳腺癌的诊断、精准治疗提供理论基石。目的:通过生物信息学分析,发现参与乳腺癌发生发展及预后相关的核心基因ANLN,并预测靶向核心基因miR-16-5p。分析探讨miR-16-5p/ANLN对乳
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背景:乳腺癌是常见的女性恶性肿瘤,患病风险呈不断上升趋势。尽管对乳腺癌的诊疗取得较大进步,但其总生存期仍较短。生物信息学是近年来新兴学科,通过利用多学科结合技术揭示与乳腺癌基因层面发病机制,鉴定驱动基因,可为乳腺癌的诊断、精准治疗提供理论基石。目的:通过生物信息学分析,发现参与乳腺癌发生发展及预后相关的核心基因ANLN,并预测靶向核心基因miR-16-5p。分析探讨miR-16-5p/ANLN对乳腺癌细胞增殖的生长作用,为乳腺癌分子靶点挖掘和治疗靶点提供理论基石和实验基础。方法:1.通过R语言下Limma、ggplot2等相关软件包对GSE86374数据进行分析,鉴定乳腺癌核心基因,通过分析GSE29431、GSE42568及TCGA乳腺癌数据对核心基因进行验证,通过HPA蛋白质数据库及临床组织标本进行免疫组化验证ANLN在乳腺癌组织水平表达情况。2.通过生物信息学预测靶向调控核心基因的miRNAs,并通过双荧光素酶实验对靶向关系进行验证。3.采用q RT-PCR技术检测不同乳腺癌细胞株及乳腺上皮细胞miR-16-5p、ANLN基因表达水平。4.将实验分组为miR-16-5p mimics、miR-16-5p NC、si-ANLN、si-NC及miR-16-5p mimics+si-ANLN,采用q RT-PCR技术检测不同分组中miR-16-5p、ANLN核酸表达水平,采用Western blot技术检测细胞不同分组中ANLN蛋白表达水平。5.通过MTT、Transwell、划痕、流式细胞术检测不同分组中细胞增殖、迁移、周期及侵袭能力等。结果:1.通过分析GSE86374发现195个显著差异表达基因,通过对差异基因行富集分析、蛋白互作分析,鉴定出核心基因ANLN参与多个细胞增殖的生物学过程,通过生存分析发现ANLN高表达与乳腺癌患者预后差相关;通过分析GSE29431、GSE42568及TCGA乳腺癌数据证实ANLN基因在乳腺癌中高表达;通过免疫组化实验再次证实ANLN在乳腺癌组织水平高表达。2.通过Target Scan、miRWalk和miRDB数据库预测miR-16-5p靶向核心基因ANLN m RNA,通过双荧光素酶报告基因实验证实miR-16-5p结合核心基因ANLN,并调控核心基因ANLN转录。3.通过qRT-PCR实验发现:对比正常乳腺上皮细胞,不同乳腺癌细胞系中miR-16-5p表达水平较低（p＜0.05）,核心基因ANLN表达水平均较高（p＜0.05）,且二者具有负调控靶向关系。4.通过qRT-PCR实验分析不同分组下基因表达情况,发现相对于对照组,转染miR-16-5p mimics或si-ANLN后,ANLN基因表达降低（p＜0.05）,转染miR-16-5p mimics+si-ANLN后ANLN基因表达显著减低（p＜0.05）;转染后Western blot显示:对比对照组,转染miR-16-5p mimics或si-ANLN后,ANLN蛋白水平降低,转染miR-16-5p mimics+si-ANLN后ANLN蛋白水平显著减低（p＜0.05）。5.通过MTT实验检测不同分组下细胞增殖能力,发现转染miR-16-5p mimics后乳腺癌细胞生长速度逐渐降低（p＜0.05）,转染si-ANLN细胞生长速度明显降低（p＜0.05）,同时转染miR-16-5p mimics+si-ANLN抑制细胞生长更显著（p＜0.05）。6.通过划痕实验、Transwell检测不同分组下细胞迁移、侵袭能力,发现转染miR-16-5p mimics后,细胞迁移、侵袭能力降低（p＜0.05）,同时转染miR-16-5p mimics+si-ANLN比转染si-ANLN细胞迁移、侵袭受抑制更显著（p＜0.05）。7.通过流式细胞术检测不同分组下细胞周期及凋亡情况,发现转染miR-16-5p mimics、si-ANLN及miR-16-5p mimics+si-ANLN均可观察到细胞阻滞于G2/M期及均促进细胞凋亡率增加（p＜0.05）,且miR-16-5p mimics+si-ANLN细胞凋亡率最高（p＜0.05）。结论:1.ANLN在乳腺癌中上调,其高表达预示乳腺癌患者预后差;2.miR-16-5p通过下调ANLN表达抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移,并影响细胞周期并促进细胞凋亡;3.miR-16-5p和ANLN可能为乳腺癌诊断和靶向治疗提供潜在的分子靶点。
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