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Lgr5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5)是肠上皮干细胞(intestinal epithelial stem cells,IESCs)的标记基因,它标记的是隐窝基底柱状(crypt-base columnar,CBC)细胞。为了研究猪Lgr5对肠上皮细胞增殖的影响,本试验通过克隆猪Lgr5基因,运用生物信息学方法分析预测了其结构与功能;通过构建Lgr5-pc DNA3.1+载体,获取Lgr5过表达的IPEC-J2稳转细胞株。运用细胞计数和MTT法检测Lgr5过表达后对IPEC-J2细胞增殖的影响,应用Western blot法检测Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白的表达水平。利用Wnt/β-catenin信号通路激动剂Wnt3a处理对照组细胞和Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV939处理Lgr5过表达组细胞后,分别检测其对细胞增殖与Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白表达水平的影响,解析猪Lgr5促进肠上皮细胞增殖的机制。为开展Lgr5标记的猪肠上皮干细胞研究奠定基础。试验结果如下:(1)猪Lgr5 c DNA的克隆运用3’RACE(Rapid amplification of c DNA ends,RACE)、同源性克隆和重叠PCR的方法,克隆获得了猪Lgr5 c DNA序列,全长2824 bp,其中编码区(coding sequence,CDS)长2724 bp,3’非编码区(untranslated region,UTR)长108 bp。(2)猪Lgr5的生物信息学分析猪Lgr5蛋白经预测为膜蛋白,含有信号肽和7次α螺旋跨膜结构,与人Lgr5蛋白氨基酸序列的同源性高达90.30%;进化树分析发现猪Lgr5蛋白是一个种保守性蛋白。(3)Lgr5在IPEC-J2细胞中过表达的鉴定构建过表达载体Lgr5-pc DNA3.1+,并获得稳定表达Lgr5的IPEC-J2细胞株。Real-time PCR和Western blot检测结果显示,在接种72 h,Lgr5过表达组Lgr5 m RNA丰度和蛋白表达水平均显著高于(P<0.05)对照组。(4)Lgr5过表达促进IPEC-J2细胞增殖细胞计数和MTT检测结果显示,与对照组相比,Lgr5过表达组的细胞在接种48h后增殖能力显著提高(P<0.05)。(5)Lgr5过表达激活Wnt/β-catenin信号通路收集细胞生长72 h的细胞样品。Western blot检测结果显示,与对照组相比,Lgr5过表达组Axin2、GSK-3β蛋白表达水平显著降低(P<0.05),β-catenin、c-Myc和cyclin D1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。(6)Lgr5激活Wnt/β-catenin信号通路促进IPEC-J2细胞增殖Wnt3a组细胞增殖能力在Wnt3a处理48 h显著高于对照组(P<0.05);与对照组相比,在Wnt3a处理48 h,Wnt3a组的Axin2和GSK-3β蛋白表达水平显著降低(P<0.05),β-catenin、c-Myc、cyclin D1和Lgr5蛋白表达水平显著升高(P<0.05);XAV939组细胞增殖能力在XAV939处理24 h和48 h后显著低于(P<0.05)Lgr5过表达组;与Lgr5过表达组相比,在XAV939处理48 h,XAV939组的Axin2和GSK-3β蛋白表达水平显著升高(P<0.05),β-catenin、c-Myc、cyclin D1和Lgr5蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论:(1)首次克隆了猪Lgr5含有完整CDS的c DNA序列;(2)猪Lgr5可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进猪肠上皮细胞增殖。