CLCA1对胃细胞功能的影响及促进胃肠上皮化生发生的分子机制

来源 :遵义医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:goudongxi521
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背景和目的:胃肠上皮化生是一种临床常见的胃部病变,与胃癌的发生密切相关。胃肠上皮化生的机制仍然未完全阐明。CLCA1是一种氯离子通道调节蛋白,GEO数据库显示CLCA1在胃肠上皮化生组织中明显上调,提示CLCA1可能参与了胃肠上皮化生的发生发展。本研究旨在探索CLCA1对一系列细胞功能学的影响及其促进胃肠上皮化生发生发展过程中的分子机制研究,从而为胃肠上皮化生的防治提供更多的理论依据。方法:本实验主要包括三个部分。1.第一部分通过免疫组织化学技术检测CLCA1在人正常胃黏膜组织、非萎缩性胃炎、肠上皮化生及胃癌组织中的蛋白表达水平。2.第二部分关于CLCA1对胃正常黏膜细胞及胃癌细胞功能学的影响。(1)通过Western-Blot技术检测CLCA1蛋白在人正常胃黏膜细胞株GES-1和人胃癌细胞株SGC-7901、MKN28、BGC-823、MKN45、AGS中的表达情况。(2)运用慢病毒在GES-1细胞中过表达及沉默CLCA1,并通过96孔板倍比稀释法挑选单克隆稳转株.通过q RT-PCR筛选出高转染效率的单克隆稳转株。(3)检测CLCA1对GES-1细胞的生物学行为的影响:运用CCK8增殖实验及生长曲线检测细胞增殖;应用平板集落形成实验检测细胞集落形成能力;运用细胞划痕实验及Transwell实验检测细胞迁移和侵袭;运用流式双染法(Annexin V-FITC/PI)检测细胞凋亡。(4)运用慢病毒感染AGS细胞,通过q RT-PCR验证AGS细胞沉默CLCA1基因是否成功;运用CCK8增殖实验检测细胞增殖;运用Transwell实验检测细胞迁移和侵袭。(5)运用慢病毒感染MKN28细胞株,通过q RT-PCR验证MKN28细胞过表达CLCA1基因是否成功;运用CCK8增殖实验检测细胞增殖;运用Transwell实验检测细胞迁移和侵袭。3.第三部分关于CLCA1促进胃肠上皮化生发生的分子机制及相关通路研究。(1)运用q RT-PCR及Western-Blot技术检测GES-1细胞过表达及沉默CLCA1,检测肠化生相关基因(CDX2、MUC2、MUC5AC、TFF2、KLF4),研究CLCA1对肠化相关基因的调控作用。(2)运用Western-Blot技术检测GES-1细胞过表达及沉默CLCA1对STAT3磷酸化蛋白及CDX2、TFF2及KLF4蛋白表达的影响情况。通过使用STAT3通路抑制剂检测GES-1细胞的STAT3磷酸化水平及CDX2、TFF2、KLF4蛋白表达的改变,研究CLCA1促进肠上皮化生的机制。(3)进行IL-13细胞诱导实验,检测IL-13对CLCA1的诱导作用及促进肠化生的相关机制研究。结果:1.第一部分:免疫组化的结果显示CLCA1在人胃肠上皮化生中表达显著高于人胃正常黏膜组织,胃炎组织及胃癌组织(P<0.001)。2.第二部分:(1)Western-Blot的结果显示CLCA1在人胃黏膜细胞GES-1和人胃癌细胞AGS、MKN28、MKN45、SGC-7901、BGC-823中均有表达,CLCA1在AGS细胞中表达最高,在MKN28细胞中表达最低,在GES-1细胞中表达居中。(2)通过过q RT-PCR及Western-Blot在GES-1细胞过表达和沉默CLCA1中,筛选出多个转染效率高的单克隆稳转株。(3)在GES-1细胞中筛选的单克隆稳转株进行各项细胞功能学结果显示如下:CCK-8结果显示:CLCA1过表达促进了GES-1细胞增殖(p<0.05),CLCA1沉默抑制了GES-1细胞增殖(p<0.001);生长曲线的结果显示:CLCA1过表达促进细胞增殖明显增多(p<0.01);平板集落形成实验结果显示:过表达CLCA1促进GES-1细胞集落数及面积增加(p<0.05);细胞划痕的实验结果显示:过表达CLCA1促进了GES-1细胞的迁移(p<0.05);Transwell实验结果显示:过表达CLCA1促进了GES-1细胞的迁移和侵袭(p<0.01);流式细胞术检测细胞凋亡的结果显示:CLCA1抑制了GES-1细胞的早期凋亡和晚期凋亡(p<0.001)。(4)q RT-PCR的结果显示:在AGS细胞中沉默CLCA1,CLCA1m RNA水平明显下调(p<0.01);CCK-8结果显示:沉默CLCA1抑制了AGS细胞的增殖(p<0.001);Transwell实验结果显示:沉默CLCA1抑制了AGS细胞的迁移和侵袭(p<0.01)。(5)q RT-PCR的结果显示:在MKN28细胞中过表达CLCA1,CLCA1m RNA水平明显上调(p<0.001);CCK-8结果显示:CLCA1过表达促进MKN28细胞的增殖(p<0.01);Transwell结果显示:过表达CLCA1促进MKN28细胞的迁移和侵袭(p<0.01)。3.第三部分:(1)在GES-1细胞中,CLCA1过表达组能够促进CDX2等肠上皮化生相关基因的表达(p<0.05);沉默CLCA1组抑制了它们的表达(p<0.05),说明CLCA1促进肠化生相关基因的表达。(2)通过Western-Blot检测CLCA1对STAT3信号通路的调控及STAT3信号通路对CDX2等肠化相关蛋白的影响。在GES-1细胞中加入STAT3通路抑制剂JSI-124能够抑制CDX2、TFF2及KLF4蛋白表达,结合STAT3通路抑制剂JSI-124能够逆转过表达CLCA1对P-STAT3、CDX2、KLF4、TFF2表达的上调,得出结论:CLCA1可以通过STAT3通路调控CDX2等肠化相关蛋白的表达(p<0.05)。(3)在IL-13诱导实验中,IL-13能够诱导CLCA1过表达组及空转组的CLCA1、P-STAT3、CDX2、TFF2、KLF4蛋白的表达。但是不能诱导CLCA1沉默组的CLCA1、P-STAT3、CDX2、TFF2、KLF4的表达,表明了IL-13通过CLCA1调控肠化相关蛋白的表达。结合STAT3通路抑制剂JSI-124能够逆转IL-13对P-STAT3、CDX2、KLF4、TFF2表达的上调,得出结论:IL-13促进CLCA1的分泌并通过STAT3通路调控肠化相关蛋白(CDX2、KLF4、TFF2)的表达(p<0.05)。结论:CLCA1影响了胃黏膜细胞的功能及行为,通过STAT3信号通路促进肠上皮化生的发生。CLCA1有望成为一种新的肠化相关标志基因。
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