男性不育发生和发展是一个多基因参与的复杂过程,近年来发现有很多基因参与了这一过程,其中有不少基因的功能已被明确。这些已知的基因如何与其它的基因相互作用来调控精子的生成过程,以及是否存在其它的未知基因参与精子的发生目前尚不完全清楚。因此克隆新的睾丸发育、生精相关基因并进一步阐明其功能是了解生殖细胞发生机理和生物学过程的关键,对阐明精子的发生的生理、病理具有重要意义。我院泌尿外科长期以来致力于男性不育领域的临床和基础方面的研究,并积累了丰富的研究资料。2005年我科蒋先镇、阳建福等采用生物信息学分析结合实验验证的方法克隆了一个在人类睾丸组织中特异性高表达的新基因(GenBank登录号为DQ168992),命名为TDRG1 (Testis Development Related Gene 1),生物信息学预测表明,TDRG1基因含有303bp(504bp - 806bp)的完整开放阅读框(Open Reading Frame, ORF),编码100个氨基酸。前期我们对TDRG1基因在人多种组织中的表达进行RT-PCR分析,发现该基因仅在正常青春期及成年男性睾丸中高表达,而在其他组织中无明显表达,表明它是一个在人睾丸组织中特异表达的基因,提示它可能与睾丸的功能有关系。同时我们利用半定量RT-PCR法分析TDRG1基因在人类睾丸不同发育阶段的表达,发现TDRG1在4个月和6个月的胎儿睾丸中无表达,在15岁少年睾丸中强表达,在33岁青年睾丸中表达稍减弱,而在74岁老年男性睾丸组织中的表达明显减弱,进一步提示TDRG1与生精功能以及男性性成熟有关。为了明确TDRG1的功能,我们进行了深入的研究。本课题获得国家自然科学基金资助(项目编号30672090),课题由以下五部分组成。第一章人睾丸基因TDRG1在不同物种间同源序列的分析目的：克隆人类睾丸特异基因TDRG1在不同物种间的同源序列,为研究该基因功能寻找动物模型。方法：以人TDRG1基因全长序列作为查询序列,利用BLASTN软件检索小鼠、大鼠和黑猩猩基因组数据库。RT-PCR和免疫组化染色初探TDRG1在不同物种间同源基因的表达。结果：生物信息学分析表明小鼠和大鼠基因组中未检索到与TDRG1同源的序列,而黑猩猩基因组中有相似性为98%的同源序列存在。RT-PCR和免疫组化染色检测结果也表明小鼠和大鼠睾丸中无同源序列和同源蛋白表达。结论：TDRG1基因在小鼠和大鼠睾丸中无同源基因及蛋白表达,而在黑猩猩睾丸中有同源序列存在,为今后建立动物模型提供了理论依据。第二章人睾丸特异基因TDRG1单克隆抗体的制备及鉴定目的：构建原核质粒表达TDRG1重组蛋白,免疫小鼠制备单克隆抗体(mAb),并鉴定其生物学特性；方法：用逆转录聚合酶链反应法从成人睾丸组织中扩增TDRG1编码序列,将其克隆到pET21原核表达载体,在大肠杆菌BL2(DE3)内进行诱导表达TDRG1重组蛋白。以纯化后的重组蛋白免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备抗TDRG1的mAb。用Western Blot法和免疫组化染色法鉴定mAb的特异性,用间接ELISA法检测mAb腹水效价；结果：成功构建了pET21/TDRG1原核表达质粒,得到了纯度较高的重组蛋白。免疫小鼠后获得了2株能稳定分泌抗TDRG1的mAb杂交瘤细胞系, WB结果显示该单克隆抗体特异识别TDRG1和睾丸组织提取裂解液,免疫组化结果显示该蛋白定位于睾丸各级生精细胞胞浆,腹水mAb效价高达1：1.6×106；结论：所获得的重组TDRG1蛋白纯度高,免疫抗原性强,成功制备了抗TDRG1的mAb,为进一步研究TDRG1基因功能奠定了基础。第三章TDRG1蛋白在多组织中的表达分析及功能初探目的：从蛋白质水平验证TDRG1在人睾丸组织中的表达,探讨TDRG1蛋白在人不同组织以及不同发育阶段睾丸组织中的表达情况,初步探明TDRG1蛋白的功能；方法：使用免疫组化染色法确定TDRG1蛋白在人睾丸组织中的表达,免疫组化染色确定TDRG1蛋白在人多种组织中的表达情况,Real-time PCR和免疫组化染色确定TDRG1在人不同发育阶段睾丸组织中的表达水平；结果：TDRG1蛋白特异地表达于人睾丸组织,在心、肝脏、脾脏、胃、结肠、直肠、食道等正常组织中无表达。免疫组化染色显示TDRG1蛋白的表达定位于人睾丸的曲细精管中,在生精细胞上有明确的阳性表达,而在基底膜和精子细胞中未见明显表达；免疫组化染色显示了TDRG1蛋白在成人睾丸组织中高表达,在老年睾丸组织中表达减弱。Real-time PCR结果亦显示TDRG1基因在成年人睾丸中高表达,而在老年人睾丸组织中表达减弱,在胎儿睾丸中表达极低；结论：本研究从蛋白质水平验证了TDRG1基因在睾丸组织中的表达,TDRG1为睾丸特异表达蛋白,表达于人生精细胞,参与精子的生成。第四章TDRG1蛋白在睾丸肿瘤发生中的作用目的：探讨人睾丸基因TDRG1在睾丸肿瘤组织中的蛋白表达及其临床病理学意义；方法：运用组织芯片技术、免疫组化法检测人睾丸特异基因TDRG1在睾丸肿瘤组织和正常睾丸组织中的表达；结果：TDRG1蛋白在精原细胞瘤和睾丸畸胎瘤中的表达较正常人睾丸对照组显著降低(P<0.05),而在睾丸胚胎癌、睾丸卵黄囊瘤、睾丸结核和睾丸萎缩组织中的表达较正常人睾丸对照组降低,统计学分析无显著性差异(P>0.05)；结论：TDRGl蛋白的表达降低与睾丸肿瘤的发生明显相关,推测TDRG1蛋白的功能可能与抑制某些类型的睾丸肿瘤发生相关,TDRG1可能是候选的抑癌基因。第五章人睾丸基因TDRG1重组真核载体的构建及其表达目的：构建人睾丸基因TDRGl的真核表达质粒,并研究其表达；方法：取人新鲜正常睾丸组织,提取总RNA,采用逆转录-聚合酶联链反应(RT-PCR)扩增TDRG1基因编码序列；将该基因克隆到真核表达载体pYD5中,构建真核细胞表达载体pYD5-TDRG1，用限制性内切酶酶切分析及DNA序列分析鉴定重组质粒；将测序正确的重组质粒pYD5-TDRG1在脂质体介导下转染293细胞,间接免疫荧光法和Western Blot法鉴定目的蛋白质的表达；结果：RT-PCR扩增出TDRG1基因编码序列,目的插入片段长约303bp；产物行限制性内切酶酶切后连接到真核表达载体pYD5,重组质粒pYD5-TDRG1经酶切及DNA测序鉴定构建成功；该质粒转染293细胞48小时后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,细胞阳性表达率约80%；行Western blot分析检测到约39.8kD(该分子量为绿色荧光蛋白GFP+目的蛋白之和)的目的蛋白表达；结论：成功构建了人类睾丸基因TDRG1的真核表达载体pYD5-TDRG1, TDRG1基因在293细胞内成功表达。