目前，全球范围内环境重金属污染严重，利用植物修复技术来清除重金属污染是现在研究的热点。对重金属耐性或富集相关基因的功能及作用机理的研究将有助于植物修复技术的发展与应用。本文以重金属超富集模式植物遏蓝菜(Thlaspi caerulescens)和印度芥菜(Brassicajuncea)为研究对象，从Cd胁迫的遏蓝菜的cDNA文库中差异筛选到一个Cd响应转录因子TcWRKY53，并对其功能进行了深入研究；利用RACE-PCR技术克隆了遏蓝菜NRAMP金属转运蛋白家族成员TcNRAMP4基因，对其与本实验室之前克隆的同一家族成员TcNRAMP3，以及印度芥菜植物络合素合酶基因BjPCS1进行了功能分析。　　 一、差异筛选法克隆Cd响应转录因子TcWRKY53及其功能分析　　 从Cd胁迫的遏蓝菜cDNA文库中，利用差异筛选的方法，首次从遏蓝菜中克隆到一个Cd响应的WRKY家族转录因子基因，并将其命名为TcWRKY53。序列分析表明，TcWRKY53全长1341bp，含有一个完整的975bp的开放读码框(ORF)，编码一个含有324个氨基酸的蛋白，推测其分子量为35.87kD，等电点(pI)为5.72。TcWRKY53编码的蛋白含有一个WRKY结构域和一个C2HC型的锌指结构，属于典型的第三类WRKY家族转录因子。TcWRKY53以两拷贝的形式存在于遏蓝菜的基因组中，含有两个内含子。TcWRKY53基因在根、茎、叶中都有表达，但表达量很低。在受到各种环境胁迫时，如寒、旱、盐、各种重金属以及外源施加SA均能诱导其大量表达，但在不同诱导条件下表达量存在差异。酵母单杂交结果显示，TcWRKY53具有转录激活能力，且C末端的84个氨基酸是TcWRKY53中主要的转录激活区域。　　 在大肠杆菌中原核表达TcWRKY53蛋白，诱导温度为37℃，诱导剂IPTG浓度为1mM，诱导时间为3 h，该条件下外源蛋白表达量最高。应用Ni-NTA亲和层析纯化回收TcWRKY53。凝胶阻滞实验表明，TcWRKY53表达蛋白具有与W-box结合特性。通过TcWRKY53蛋白-DNA体外结合实验，分离得到了两个与TcWRKY53结合的启动子序列W53BP1和W53BP2，它们都含有W-box的核心序列TGAC。通过PCR扩增W53BP1片段的编码区序列，并在GenBank上进行比对，发现与遏蓝菜Zn/Cd转运蛋白基因TcZNT1(AJ313521)序列一致，说明W53BP1为TcZNT1基因的启动子片段。而W53BP2片段包含的一段编码区序列，与GenBank中拟南芥LBD33(NM_120690)的编码区具有91％的同源性，表明W53BP2片段为遏蓝菜某个LBD家族基因(lateral organ boundaries)的启动子区。　　 35S∷TcWRKY53基因转化烟草品种NC89，GUS染色结果显示TcWRKY53在细胞核中特异表达。对转基因烟草的抗逆性分析表明，过量表达TcWRKY53基因导致植株对20％PEG6000模拟的旱胁迫的抗性降低。利用real-time PCR技术对转基因和野生型烟草中3个渗透胁迫相关基因的表达进行了分析。结果表明在无胁迫条件下，转基因烟草中2个ERF家族的转录因子NtERF5和NtEREBP-1表达量下降，而LEA家族的NtLEA5基因的表达量则无明显变化。PEG胁迫以后的转基因烟草中，这3个基因的表达被进一步下调，从而我们推断TcWRKY53在渗透胁迫下，通过调节ERF家族转录因子来间接调节相关的功能基因，而不是对功能基因进行直接的调控。另外转基因烟草对重金属Cd胁迫的抗性下降，这与前面体外结合实验的结果相吻合，证明TcWRKY53确实能够调控重金属转运蛋白的表达，是参与植物重金属胁迫信号传导途径的一个新的转录因子。同时也说明了植物在响应重金属胁迫与其它环境胁迫，如渗透胁迫之间的信号传导途径存在着交叉现象，而WRKY家族转录因子就是这些途径中的交叉点。　　 二、遏蓝菜金属离子转运蛋白基因TcNRAMP3/4的克隆与功能分析　　 以遏蓝菜为实验材料，采用RACE-PCR的方法，克隆得到一个NRAMP家族金属离子转运蛋白基因TcNRAMP4。该基因全长1829bp，完整阅读框包含1536个碱基，编码一个含有512个氨基酸的蛋白，推测其分子量为56.33kD。RT-PCR法克隆了本实验室之前分离到的TcNRAMP3基因。其中TcNRAMP4基因在根、茎、叶中均有表达，而TcNRAMP3基因在根部的表达量最高，茎部表达微弱，在叶中几乎检测不到它的表达。二者在非胁迫条件下有一定程度的表达，表示TcNRAMP3/4在植物正常生长条件下也发挥一定的作用。TcNRAMP3/4在各种重金属胁迫和铁饥饿条件下被大量诱导表达。Southern blot结果显示这两个基因都以单拷贝的形式存在于遏蓝菜的基因组中。　　 TcNRAMP3/4的表达能恢复运铁功能缺陷的酵母DEY1453对铁的运输，说明它们具有运输铁的能力。TcNRAMP3在酵母中的表达还提高了酵母对Ni的抗性及对Cd的敏感性，而TcNRAMP4提高了酵母对Cd、Zn的敏感性。分析酵母中的重金属的含量，发现与对照菌相比，转TcNRAMP3的酵母重组菌中Cd含量升高，Ni含量明显下降；转TcNRAMP4的酵母重组菌中Cd、Zn含量均显著提高。说明TcNRAMP3在酵母中能转运Fe、Ni和Cd等金属离子，而TcNRAMP4则具有运输Fe、Cd和Zn等金属离子的功能。进一步在烟草中分析TcNRAMP3/4的功能，结果显示，除了过表达TcNRAMP3导致转基因烟草幼苗对Cd的抗性稍下降以外，在烟草中表达TcNRAMP3对转基因烟草Ni抗性，表达TcNRAMP4对转基因烟草Cd、Zn的抗性均没有影响。并且转TcNRAMP4烟草在Cd或Zn胁迫条件下重金属富集量与对照植株也无显著差异，说明该家族基因在植物中的作用与在酵母中不完全相同，主要起到一种调节体内金属离子平衡的作用。　　 三、印度芥菜BjPCS1基因的功能分析　　 根据GenBank注册的BjPCS1基因的序列，以RT-PCR方法获得了该基因的全长cDNA。通过对转BjPCS1基因烟草在Cd、Ni和Zn胁迫下的生理指标的测定，包括脯氨酸含量、相对电导率、丙二醛含量、可溶性糖含量以及叶绿素含量的变化，说明了BjPCS1在烟草中的过表达提高了烟草对Cd、Ni和Zn的抗性。在印度芥菜中过表达BjPCS1提高了植株对Cd的抗性，而转反义BjPCS1的印度芥菜并没有表现出对Cd敏感；ICP-MS结果显示正义、反义植株以及对照植株根部Cd的富集量没有显著差别，正义植株的叶部Cd含量有所提高。植物络合素含量测量结果显示，在Cd胁迫条件下过表达BjPCS1植株PC含量明显升高，而抑制表达植株中PC含量很低，但仍然能检测到。