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为了研究单个糖基的生物学功能,本文选择糖脂和糖蛋白糖链(主要在 O-糖链,也可在 N-糖链)末端与肿瘤转移密切相关的 Lewis 抗原上的岩藻糖基(Fuc)进行研究。Lewis 抗原有唾液酸化和非唾液酸化两大类,而α1,3 岩藻糖转移酶-VII (α1,3FucT-VII)是主要催化唾液酸化的 Lewis 抗原 SLex 岩藻糖化的一个 终末糖基转移酶,使糖链的加工终止,糖链的结构不再改变。因此,只使糖链末端增加一个 Fuc 糖基的α1,3FucT-VII 可成为研究单个糖基功能的良好工具。 采用质粒转染细胞的方法将α1,3FucT-VII cDNA 转染低表达α1,3FucT-VII 的人H7721 肝癌细胞,较全面地观察转染后引起的一系列生物学效应,可在一定程度上反映 SLex中岩藻糖基的功能。 全文分下列四个部分: 第一部分 α1,3FucT-VIIcDNA转染对 H7721 细胞表面某些受体 SLex 抗原的表达及受体功能的影响 首先建立了稳定表达不同量α1,3FucT-VII 的 H7721 细胞株,经α1,3FucT-VII 的mRNA 和细胞表面总 SLex 抗原的表达(α1,3FucT-VII 产物)检测,转染空质粒的Mock/H7721 也有一定量的α1,3FucT-VIImRNA 和 SLex 的表达,故为低表达细胞株, 另两株转染α1,3FucT-VII cDNA 的为中表达细胞株 FucTVII-M 和高表达细胞株FucTVII-H。 为了研究α1,3FucT-VII 转染对 H7721 细胞表面某些受体上 SLex 抗原的表达及受体功能的影响,选择了具有代表性的两个生长因子受体---胰岛素受体(InR)和表皮生长因子受体(EGFR),其中 InR 是α,β双亚基组成的,而 EGFR 则是单亚基的,还选择了另一类非生长因子受体而与细胞粘附和迁移有关的 Fn 受体――整联蛋白(Integrin) α5β1 作为我们的研究对象。结果发现:1. α1,3FucT-VII 转染使细胞膜表面和细胞内总的 InR 和 EGFR 的表达都没有发生明 显变化;免疫沉淀测定的 InR 和 EGFR 的表达也没有发生明显变化。2. α1,3FucT-VII转染使InRα亚基上SLex抗原的表达增高,而不同的转染细胞中EGFR 上的 SLex表达没有发生变化。3. α1,3FucT-VII cDNA 转染使 InRβ 亚基自身酪氨酸磷酸化水平升高,而 EGFR 的自 1<WP=5>身酪氨酸磷酸化水平没有发生改变。4. α1,3FucT-VII cDNA 转染使 IRS-1 蛋白量降低,而平均每分子 IRS-1 的酪氨酸磷酸 化水平显著升高。5. α1,3FucT-VII cDNA 转染对平均每分子纤连蛋白受体 Integrin α5 和 β1 亚基 的 SLex 表达无明显影响,而上调 Integrin α5 亚基的表达, 但对 β1 亚基表达无影响。6. α1,3FucT-VII cDNA 转染使 7721 细胞对 Fn 的粘附和铺展能力增强。 以上 InRα 亚基上 SLex 抗原的表达,InRβ 亚基和 IRS-1 的酪氨酸磷酸化水平,Integrin α5 亚基的表达,对 Fn 的粘附和铺展能力,均是 FucTVII-H/H7721>FucTVII-M/H7721>Mock,和α1,3FucT-VII mRNA 的表达水平相一致。可见上述变化可能都是α1,3FucT-VII cDNA 转染后使胰岛素受体上 SLex 的增高而引起的结果。但IRS-1 蛋白量的表达是例外,为 FucTVII-H/H7721< FucTVII-M/H7721<Mock。 第二部分 α1,3FucT-VIIcDNA 转染对 H7721 细胞重要信号转导 通路的影响 在第一部分已发现 α1,3FucT-VII 转染可改变细胞表面胰岛素受体(InR)SLex 的表达和自身酪氨酸磷酸化功能, 那么,细胞表面 InR 糖链结构与功能的改变能不能进一步引起下游信号分子表达或磷酸化的变化?这是本部分研究的问题。结果发现:1. α1,3FucT-VII 转染细胞与 Mock 细胞相比,PKB 蛋白质的表达没有明显改变,但 PKB-T308 和 S473 的磷酸化和 PKB 活力均上调,均是 FucTVII-H/H7721> FucTVII-M/H7721;PKB 的 S473 磷酸化的升高程度要高于 T308。SLex 单抗 KM93 和胰岛素受体酪氨酸磷酸化的特异性抑制剂HNMPA-(AM)3可大部分消除PKB磷酸 化的差别。2. α1,3FucT-VII 转染的 H7721 细胞中 PDK-1 升高,PKN 的表达及磷酸化均显著升高; PI-3K 的特异性抑制剂 LY294002 可明显抑制 PKN 蛋白的表达和磷酸化水平,使不 同转染细胞中的差别明显降低。3. α1,3FucT-VII 转染的 H7721 细胞中 c-Raf-1 表达明显上调;而 p42/44 MAPK 和 MEK 蛋白质的表达与 Mock 细胞相比没有明显差别,但它们的磷酸化水平上调,增高程 度明显超过 PKB 磷酸化的增高程度,可能与 Raf 的上调有关;KM93 和 HNMPA-(AM)3 也可明显消除不同转染细胞中 p42/44 MAPK 磷酸化的区别。4. α1,3FucT-VII 转染的 H7721 细胞中 β-Catenin 蛋白表达明显上升,其下游的转录因 子 TCF 的活力也相应地明显增强。5. 在 Fn 存在下,α1,3FucT-VII 转染的 H7721 细胞中 FAK 的蛋白表达没有发生改变, 但它的酪氨酸磷酸化水平上升. 2<WP=6>以上这些测定过的信号分子参与一些信号转导通路,并互相串话而形成网络。α1,3FucT-VII 活化的信号转导网络可用下图表示:本部分虽然没有测定 ILK、Ras 和PI-3K,但有理由推测它们在α1,3FucT-VII 转染细胞中也是增高的。 ?