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目的完善原始卵泡的体外培养技术;探索原癌基因c-erbB2在大鼠原始卵泡启动生长过程中的表达变化及可能的作用。方法(1)选择2日龄SD大鼠,建立Waymouth和DMEM两种卵巢体外培养体系,用组织切片和HE染色法观察原始卵泡启动生长情况,用免疫组化和Western blot方法检测卵泡活化生长的重要标志物——增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况,以判断原始卵泡在两种培养体系中的生长状态,挑选出适合原始卵泡生长发育的体外培养体系。(2)用原位杂交、RT-PCR和免疫组化方法检测c-erbB2 mRNA和蛋白在原始卵泡启动生长中及在表皮生长因子(EGF)作用下的表达情况。(3)用Western blot方法同步测定p-ERK1/2蛋白在原始卵泡启动生长中及在EGF作用下的表达情况,并分析与c-erbB2 mRNA表达变化的相关关系。结果(1)经组织形态学的比较、各级正常卵泡数量的计算及PCNA表达情况的分析显示,原始卵泡在Waymouth培养体系中存活和生长情况优于DMEM培养体系;并观察到在Waymouth培养体系中加入50ng/ml EGF能进一步促进原始卵泡启动生长。(2)原位杂交结果显示,c-erbB2 mRNA在大鼠原始卵泡生长过程中均有表达,主要位于卵母细胞胞浆内,有随卵泡生长逐渐增加趋势;半定量RT-PCR结果显示,c-erbB2 mRNA表达在2日龄大鼠卵巢培养8d后与培养0d(对照组)相比显著增加(相对光密度值分别为0.297±0.018和0.178±0.011,P<0.05),并在50ng/ml EGF作用下进一步增强;免疫组化结果显示,ErbB2蛋白在大鼠原始卵泡生长过程中均有表达,主要表达于卵母细胞胞膜上,也有随卵泡生长逐渐表达增强的趋势。(3)Western blot结果显示,磷酸化细胞外信号调节激酶1/2 (p-ERK1/2)也随卵泡发育其含量不断增加,在50ng/ml EGF作用下进一步增强。经Spearman相关分析表明,在原始卵泡启动生长过程中,p-ERK1/2含量的变化与c-erbB2 mRNA的表达变化呈显著的正相关关系(rs=0.900,P<0.05)。结论(1)建立了新生大鼠卵巢体外培养体系。(2)原始卵泡中有c-erbB2 mRNA及蛋白的表达,且随原始卵泡的启动生长过程表达增强,EGF在促进原始卵泡启动生长的同时,也使c-erbB2 mRNA及蛋白的表达增强,表明原癌基因c-erbB2在原始卵泡启动生长中起重要作用。(3)在原始卵泡启动生长中,p-ERK1/2含量的变化与c-erbB2 mRNA的表达变化非常一致,两者呈显著的正相关关系,ERK-MAPK信号通路可能在介导原癌基因c-erbB2调控原始卵泡生长中起作用。