目的:角膜新生血管是角膜受到有害刺激产生的一种病理改变,严重者能够致盲。目前临床药物治疗通常包括局部使用激素抗炎药物和局部非处方使用抗血管内皮生长因子药物。激素类药物以抗炎为主、抗新生血管作用相对弱,且副作用较大;以大分子化合物为主的抗血管内皮生长因子类药物因角膜屏障作用眼表吸收受限,且只对部分患者有效。木蝴蝶是一种传统中药,主要成分包括黄芩素、木蝴蝶苷A、白杨素和木蝴蝶苷B四种具有相同母核结构的黄酮类化合物,其中木蝴蝶苷A、白杨素和黄芩素已被证明具有抗炎和抗新生血管的双重作用,白杨素和黄芩素在眼科的应用已有相关报道。但这两种化合物在中性和微酸性条件溶解度差,制备眼用制剂的难度较大;而木蝴蝶苷B是上述几种化合物中羟基最多水溶性最好的,已被证明具有抗炎和抗肿瘤作用。本研究首先通过体外实验证实木蝴蝶苷B具有抗新生血管的作用,再将木蝴蝶苷B制备成滴眼液用于大鼠角膜新生血管分析,旨在评估该滴眼液的治疗作用并探索潜在机制,同时考察局部点眼后木蝴蝶苷B在眼组织的药物代谢动力学特征,为角膜新生血管临床用药提供新的选择和参考。研究方法:1、CCK8法检测木蝴蝶苷B对VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelia cell,HUVEC）增殖作用的影响;划痕实验、Transwell和成管实验评价木蝴蝶苷B对VEGF诱导的HUVEC迁移和管腔形成的影响。2、利用相溶解度实验确定羟丙基-β-环糊精（hydroxypropy1-β-cyclodextrin,HP-β-CD）的包合浓度,采用饱和水溶液法制备低（0.2%）、中（0.5%）、高（1.0%）剂量木蝴蝶苷B滴眼液,并采用差示扫描量热法、红外光谱法、饱和溶解度法对包合物进行表征;建立超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography,UPLC）法考察三剂量的木蝴蝶苷B滴眼液在高温、光照、冻融及长期存放条件下的稳定性,并对该滴眼液进行眼刺激性和眼表毒性评价。3、使用大鼠角膜新生血管模型评价木蝴蝶苷B滴眼液效果:雄性180～200g SD大鼠180只,空白组30只不予处理;其余150只建立碱烧伤诱导的大鼠角膜新生血管模型。在烧伤后第1天,按体重随机分为模型组、木蝴蝶苷B滴眼液低剂量组、中剂量组、高剂量组和地塞米松阳性药组,每组30只。除空白组外,其余各组分别给予对应滴眼液,每天4次,连续给药21天;于碱烧伤后4、7、14、21天观察角膜新生血管生长情况、角膜透明度和采用0.1%荧光素钠染色观察角膜愈合情况,并取各组角膜组织进行HE染色;RT-q PCR检测Il-6、Il-1β、Vegf、Mmp-9、Mmp-2、Hif-1、Icam-1基因表达水平;Western blot、免疫组化等方法测定VEGF、MMP-9等蛋白表达水平。为了探索木蝴蝶苷B对炎症和新生血管的潜在作用机制,采用Western blot法测定VEGF处理的HUVEC VEGFR、PI3K、AKT和NF-κB蛋白水平。4、使用兔评价木蝴蝶苷B滴眼液眼组织分布和代谢情况:2～2.5 kg新西兰兔108只,雌雄兼顾,按体重随机分成单次给药组（72只,3只/组）和多次给药组（36只,3只/组）。单次给药组兔双眼分别给予一次50μL低、中、高三剂量木蝴蝶苷B滴眼液后,于0.5、1、2、4、6、8、12、24 h取血后处死,取房水、结膜、角膜、巩膜、虹膜-睫状体、晶状体;多次给药组兔双眼给予高剂量木蝴蝶苷B滴眼液,每天4次,于连续给药4、5、6天的2h和7天给药前和首次给药后取血和眼组织（组织类别及采集时间点同单次给药）,采用经过验证的超高效液相色谱-串联质谱联用（ultra-high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS）技术测定兔血浆及眼组织中木蝴蝶苷B的浓度。同时采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用（ultra-high performance liquid chromatography coupled to quardrupole time-of-fight mass spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS/MS）技术对木蝴蝶苷B眼组织代谢产物进行鉴定,寻找其可能代谢途径。结果:1、木蝴蝶苷B剂量依赖性地抑制VEGF诱导的HUVEC增殖作用。细胞划痕、Transwell以及成管实验表明30μM、60μM木蝴蝶苷B可显著降低VEGF诱导的HUVEC伤口愈合面积、细胞迁移数量以及细胞成管数量（p＜0.05）。2、相溶解度实验表明木蝴蝶苷B随着HP-β-CD浓度增加而线性增加,属于AL稳定包合型;同时确定HP-β-CD包合浓度为25%（w/v）。差示扫描量热法、红外光谱法和饱和水溶解度法证实已形成木蝴蝶苷B/HP-β-CD包合物。建立UPLC法测定滴眼液中木蝴蝶苷B含量,该方法专属性良好,木蝴蝶苷B在7.06～35.6μg/m L范围内线性关系良好;具有较好精密度和重复性;低、中、高3个浓度水平的回收率均在98.0～102%之间,方法准确度良好。同时应用该方法分别对低、中、高三剂量的木蝴蝶苷B滴眼液进行光照、高温、冻融和不同存放条件的稳定性考察,结果表明采用HP-β-CD技术制备的木蝴蝶苷B滴眼液稳定性良好。兔眼连续21天多次给予空白溶媒和木蝴蝶苷B滴眼液后,均未见引起兔眼刺激性反应和角膜、结膜毒性反应。3、建立碱烧伤的大鼠角膜新生血管模型,烧伤第4天角膜缘处出现刷状新生血管芽;第7天眼球肿胀明显,炎症反应加剧,新生血管生长迅速且管径粗大;第14天新生血管管径减少,蔓延面积增加;第21天新生血管覆盖全角膜。裂隙灯检查发现木蝴蝶苷B低、中、高剂量组可剂量依赖性减少角膜新生血管面积并降低炎症反应,结果与碱烧伤后7、14天HE染色实验结果一致。RT-q PCR实验结果表明木蝴蝶苷B滴眼液能降低Il-6、Il-1β、Vegf、Mmp-9、Mmp-2、Hif-1、Icam-1的m RNA表达水平,呈现一定剂量依赖性,中、高剂量组与模型组相比差异有统计学意义（p＜0.05）,且高剂量组与阳性药组相比差异无统计学意义;大鼠角膜的Western blot和免疫组化实验表明局部多次给予低、中、高剂量木蝴蝶苷B滴眼液可降低角膜VEGF、MMP-9等蛋白水平,中、高剂量组与模型组相比差异有统计学意义（p＜0.05）,且高剂量组与阳性药组相比差异无统计学意义。HUVEC 60μM、80μM木蝴蝶苷B处理后,VEGF诱导的HUVEC的p?VEGFR2、p?PI3K、p?Akt和p?NF-κB水平显著降低,p?VEGFR2/t-VEGFR2、p?PI3K/t?PI3K、p?Akt/t?AKT和p?NF-κb/t?NF-κB比值亦显著降低（p＜0.05）。4、建立测定兔眼组织和血浆中木蝴蝶苷B浓度的UPLC-MS/MS法,定量范围为5.00～500 ng/m L。对方法的系统适应性、选择性、残留、线性、准确度、精密度、灵敏度、稳定性、基质效应及回收率进行验证,均符合化学药物临床前药代动力学研究要求的参数。低、中、高剂量木蝴蝶苷B滴眼液兔单次点眼后木蝴蝶苷B在眼前段组织有较高的药物浓度分布,且从高到低的分布顺序为:角膜、巩膜、结膜、虹膜-睫状体≈房水、晶状体。多次给药4～6天的2 h达峰浓度无统计学差异,提示木蝴蝶苷B多次给药3天可达稳态。多次给药后的眼组织AUC0-24h约为单次给药的3倍以上,提示多次给药后眼组织药物浓度分布增加。单、多次滴眼给药后进入体循环的木蝴蝶苷B均低于检测定量下限。UPLC-Q-TOF-MS/MS检测到高剂量木蝴蝶苷B滴眼液单次滴眼后在角膜和房水中可代谢成黄芩素,2 h时转化率最高,分别达到40%和7%,随后逐渐降低。结论:木蝴蝶苷B具有抑制新生血管作用。通过环糊精包合技术制备的木蝴蝶苷B滴眼液安全稳定,能够抑制碱烧伤诱导的大鼠角膜新生血管和炎症反应,且呈现一定剂量效应关系,该效应可能与VREGR/PI3K/AKT/NF-κB通路抑制有关。局部滴眼主要分布在角膜靶组织中,达峰迅速且消除缓慢、几乎不入体循环,部分代谢成具有生物活性的黄芩素,黄芩素已被研究证明具有抑制眼部新生血管和炎症的作用。环糊精包合的木蝴蝶苷B滴眼液有望成为新一代抗角膜新生血管的候选药物,同时也为其他领域抑制新生血管提供依据和方向。