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目的：
本研究通过观察针刺“百会”透“曲鬓”穴对急性期脑出血大鼠模型的神经功能改善情况，以及对神经细胞铁死亡相关的铁稳态和脂质过氧化的影响，进一步探讨针刺通过激活“P62/keap1/Nrf2”信号通路拮抗神经细胞铁死亡脂质过氧化损伤的可能机制，丰富针刺保护急性脑出血的机制研究，为针刺治疗急性脑出血的临床应用提供理论支持。
方法：
选取健康6周龄Sprague-Dawley雄性大鼠（280±10g）若干只，适应性喂养一周后选取160只健康雄性大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、针刺组、抑制剂组，其中每组又随机分为6小时、1天、3天、7天4个亚组，每组8只。空白组不做任何干预。模型组采用自体血注入法复制脑出血大鼠模型。假手术组接受与模型组相同的各项操作，微量注射器于相同位置进针，但不注血。针刺组取穴“百会”透“曲鬓”，以0.35×40mm针灸针快速刺入，并向曲鬓穴透刺，进针深度0.8寸，施以快速捻转平补平泻手法，捻转速度为200r/min，持续捻转5min，后间隔5min，反复操作，共留针30min。每日行一次针刺治疗。抑制剂组给予每日一次肌肉注射去铁胺100mg/kg治疗。采用Ludmila Belayev评分法综合评价各组大鼠的神经功能缺损情况。HE染色观察大鼠脑组织病理形态改变。透射电镜观察大鼠脑组织线粒体形态结构改变。铁试剂盒检测大鼠脑组织铁离子含量。丙二醛（MDA）试剂盒检测大鼠脑组织内脂质过氧化物MDA含量。免疫组织化学染色法检测大鼠脑组织核因子E2相关因子2(Nrf2)、重组人铁蛋白重链(FTH1)、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）表达情况。采用免疫蛋白印迹法检测大鼠脑组织神经元特异性核蛋白（NeuN）、P62、keap1、Nrf2、FTH1、GPX4蛋白表达情况。最后用统计学软件对以上结果进行分析。
结果：
1.神经功能评分结果：正常组及假手术组大鼠在各个时间点未见明显神经功能缺损。与空白组及假手术组比较，模型组大鼠6h即表现出明显神经功能缺损（P＜0.05），1d神经功能缺损逐渐加重（P＜0.05），3d神经功能缺损达到高峰（P＜0.05），7d神经功能缺损逐渐恢复（P＜0.05）。针刺组大鼠各时间点神经功能缺损程度较同时间点模型组明显减轻（P＜0.05）。针刺组与抑制剂组大鼠神经功能评分在各时间点比较，无显著性差异（P＞0.05）。
2.HE染色结果：空白组及假手术组脑组织各类细胞形态相对完好，未见明显的病理改变。模型组大鼠脑组织可见较为明显的出血，周边组织炎性细胞大量浸润，神经元肿胀，细胞排列层次紊乱，细胞间隙空泡化较重，神经元核固缩，甚至消失，细胞大量破碎消失。针刺组较模型组损伤程度有所减轻，出血明显吸收，少量红细胞及炎性细胞浸润，神经元细胞肿胀、破碎较模型组减轻。
3.透射电镜观察结果：假手术3d组神经元胞体中线粒体形态未见明显改变，可见散在肿胀线粒体；模型3d组神经元胞体内线粒体变小、固缩明显，可见线粒体脊减少或消失，线粒体外膜增厚破裂。针刺组与抑制剂组较模型组线粒体形态改变均较轻，针刺3d组可见散在神经元胞体线粒体形态变小，线粒体膜破裂，可见肿胀的线粒体；抑制剂3d组神经元胞体线粒体略变小、溶酶体显著增加，可见肿胀的线粒体。
4.铁试剂盒、MDA试剂盒检测结果：与空白组及假手术组比较，模型组在各时间点铁含量、MDA含量均明显升高（P＜0.05）。随着时间延长，模型组铁含量、MDA含量逐渐升高，3d达到高峰，7d铁含量维持较高水平。与模型组相比，针刺组在1d、3d、7d各时间点铁含量均明显降低（P＜0.05），针刺组大鼠各时间点MDA含量较同时间点模型组明显减少（P＜0.05）。针刺组与抑制剂组相比，在各时间点铁含量、MDA含量无显著性差异（P＞0.05）。
5.免疫组化检测结果：
Nrf2阳性细胞数结果：与空白组和假手术组比较，模型组在各时间点Nrf2阳性细胞数均显著增多(P＜0.05)。针刺组与模型组比较，在1d、3dNrf2阳性细胞数显著增多(P＜0.05)。
FTH1阳性细胞数结果：与空白组和假手术组比较，模型组在1d、3d、7d各时间点FTH1阳性细胞数显著增多(P＜0.05)。与模型组比较，针刺组在1d、3d、7d阳性细胞数显著增多(P＜0.05)。
GPX4阳性细胞数结果：与空白组及假手术组比较，模型组在各时间点GPX4阳性细胞数均显著减少(P＜0.05)。与模型组比较，针刺组在各时间点GPX4阳性细胞数均较模型组显著增多(P＜0.05)。
6.免疫印迹检测结果：
NeuN蛋白表达结果：与假手术组比较，模型组大鼠在脑出血后1d、3d、7dNeuN蛋白表达显著减少（P＜0.05），3d减少达到高峰（P＜0.05），神经细胞死亡情况最重；7d有所恢复（P＜0.05）。与模型组比较，针刺组大鼠在脑出血后1d、3d、7dNeuN蛋白表达有所升高，结果具有显著性差异（P＜0.05）。针刺组与抑制剂组大鼠神经元细胞NeuN蛋白表达在各时间点比较，无显著性差异（P＞0.05）。
P62蛋白表达结果：与空白组及假手术组比较，模型组在脑出血后1d、3d、7d时间点P62蛋白表达均明显升高（P＜0.05）。模型组6h与1d、3d、7d比较，具有显著性差异（P＜0.05）。模型组3d与7d比较，无显著性差异（P＞0.05）。P62蛋白表达在脑出血后1d开始升高，3d达到高峰，7d维持在高峰。与模型组相比，针刺组在各时间点P62蛋白表达均明显升高（P＜0.05）。
Nrf2蛋白表达结果：与空白组和假手术组比较，模型组在各个时间点Nrf2蛋白表达均明显升高（P＜0.05）。模型组6h与1d、3d、7d时Nrf2蛋白表达比较，模型组3d与7d比较,均具有显著性差异（P＜0.05）。模型组6h Nrf2蛋白表达开始升高，3d达到高峰，7d下降。与模型组比较，针刺组在出血后6h、1d、3d显著增加了Nrf2的蛋白表达（P＜0.05）；在7d时针刺组Nrf2的蛋白表达较模型组明显减少（P＜0.05）。
Keap1蛋白表达结果：与空白组和与假手术组比较，模型组在脑出血后1d、3d、7d时Keap1蛋白表达均显著减少（P＜0.05）。模型组6h与1d、3d、7d时Keap1蛋白表达比较，具有显著性差异（P＜0.05）。模型组1d Keap1蛋白表达下降明显，3d下降达到高峰，7d有所升高。与模型组比较，针刺组在各时间点Keap1的蛋白表达均显著减少（P＜0.05）。
GPX4蛋白表达结果：与空白组和与假手术组比较，模型组GPX4蛋白表达在不同时间点均显著降低（P＜0.05）；模型组6h与1d、3d、7d比较，具有显著性差异（P＜0.05）。模型组1d时GPX4开始下降，3d时降低达到高峰，7d时GPX4蛋白表达有所升高。与模型组比较，针刺组在6h、1d时GPX4蛋白表达无显著性差异（P＞0.05），在3d、7d时针刺组GPX4的蛋白表达显著升高（P＜0.05）。
FTH1蛋白表达结果：与空白组及假手术组比较，模型组在各时间点FTH1蛋白表达均明显升高（P＜0.05）。模型组6h与模型组1d、3d比较，具有显著性差异（P＜0.05）。模型组6hFTH1蛋白表达开始升高，1d继续升高，3d达到高峰。与模型组相比，针刺组在1d、3d、7d时间点FTH1蛋白表达均明显升高（P＜0.05）。
结论：
1.“百会”透“曲鬓”针刺法可明显改善脑出血大鼠模型神经功能缺损及肢体运动功能。
2.“百会”透“曲鬓”针刺法可以明显改善脑出血大鼠脑组织病理形态，降低出血脑组织游离铁含量，脂质过氧化产物MDA含量，改善出血脑组织线粒体超微结构，抑制脑出血大鼠脑组织神经细胞铁死亡的发生，起到脑保护作用。
3.“百会”透“曲鬓”针刺法可激活“P62/keap1/Nrf2”信号通路，明显上调P62、下调keap1的蛋白表达，促进p62与keap1之间的相互作用，促进Nrf2的入核增多，从而增强细胞抵抗脂质过氧化损伤能力。
4.“百会”透“曲鬓”针刺法可能通过促进Nrf2的入核增多，一方面上调了FTH1蛋白表达，促进游离铁的储存和再利用，减少过氧化产物的产生；另一方面上调了GPX4蛋白表达，增加了过氧化产物的清除，抑制出血大鼠脑组织铁死亡脂质过氧化损伤过程，起到脑保护作用。
本研究通过观察针刺“百会”透“曲鬓”穴对急性期脑出血大鼠模型的神经功能改善情况，以及对神经细胞铁死亡相关的铁稳态和脂质过氧化的影响，进一步探讨针刺通过激活“P62/keap1/Nrf2”信号通路拮抗神经细胞铁死亡脂质过氧化损伤的可能机制，丰富针刺保护急性脑出血的机制研究，为针刺治疗急性脑出血的临床应用提供理论支持。
方法：
选取健康6周龄Sprague-Dawley雄性大鼠（280±10g）若干只，适应性喂养一周后选取160只健康雄性大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、针刺组、抑制剂组，其中每组又随机分为6小时、1天、3天、7天4个亚组，每组8只。空白组不做任何干预。模型组采用自体血注入法复制脑出血大鼠模型。假手术组接受与模型组相同的各项操作，微量注射器于相同位置进针，但不注血。针刺组取穴“百会”透“曲鬓”，以0.35×40mm针灸针快速刺入，并向曲鬓穴透刺，进针深度0.8寸，施以快速捻转平补平泻手法，捻转速度为200r/min，持续捻转5min，后间隔5min，反复操作，共留针30min。每日行一次针刺治疗。抑制剂组给予每日一次肌肉注射去铁胺100mg/kg治疗。采用Ludmila Belayev评分法综合评价各组大鼠的神经功能缺损情况。HE染色观察大鼠脑组织病理形态改变。透射电镜观察大鼠脑组织线粒体形态结构改变。铁试剂盒检测大鼠脑组织铁离子含量。丙二醛（MDA）试剂盒检测大鼠脑组织内脂质过氧化物MDA含量。免疫组织化学染色法检测大鼠脑组织核因子E2相关因子2(Nrf2)、重组人铁蛋白重链(FTH1)、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）表达情况。采用免疫蛋白印迹法检测大鼠脑组织神经元特异性核蛋白（NeuN）、P62、keap1、Nrf2、FTH1、GPX4蛋白表达情况。最后用统计学软件对以上结果进行分析。
结果：
1.神经功能评分结果：正常组及假手术组大鼠在各个时间点未见明显神经功能缺损。与空白组及假手术组比较，模型组大鼠6h即表现出明显神经功能缺损（P＜0.05），1d神经功能缺损逐渐加重（P＜0.05），3d神经功能缺损达到高峰（P＜0.05），7d神经功能缺损逐渐恢复（P＜0.05）。针刺组大鼠各时间点神经功能缺损程度较同时间点模型组明显减轻（P＜0.05）。针刺组与抑制剂组大鼠神经功能评分在各时间点比较，无显著性差异（P＞0.05）。
2.HE染色结果：空白组及假手术组脑组织各类细胞形态相对完好，未见明显的病理改变。模型组大鼠脑组织可见较为明显的出血，周边组织炎性细胞大量浸润，神经元肿胀，细胞排列层次紊乱，细胞间隙空泡化较重，神经元核固缩，甚至消失，细胞大量破碎消失。针刺组较模型组损伤程度有所减轻，出血明显吸收，少量红细胞及炎性细胞浸润，神经元细胞肿胀、破碎较模型组减轻。
3.透射电镜观察结果：假手术3d组神经元胞体中线粒体形态未见明显改变，可见散在肿胀线粒体；模型3d组神经元胞体内线粒体变小、固缩明显，可见线粒体脊减少或消失，线粒体外膜增厚破裂。针刺组与抑制剂组较模型组线粒体形态改变均较轻，针刺3d组可见散在神经元胞体线粒体形态变小，线粒体膜破裂，可见肿胀的线粒体；抑制剂3d组神经元胞体线粒体略变小、溶酶体显著增加，可见肿胀的线粒体。
4.铁试剂盒、MDA试剂盒检测结果：与空白组及假手术组比较，模型组在各时间点铁含量、MDA含量均明显升高（P＜0.05）。随着时间延长，模型组铁含量、MDA含量逐渐升高，3d达到高峰，7d铁含量维持较高水平。与模型组相比，针刺组在1d、3d、7d各时间点铁含量均明显降低（P＜0.05），针刺组大鼠各时间点MDA含量较同时间点模型组明显减少（P＜0.05）。针刺组与抑制剂组相比，在各时间点铁含量、MDA含量无显著性差异（P＞0.05）。
5.免疫组化检测结果：
Nrf2阳性细胞数结果：与空白组和假手术组比较，模型组在各时间点Nrf2阳性细胞数均显著增多(P＜0.05)。针刺组与模型组比较，在1d、3dNrf2阳性细胞数显著增多(P＜0.05)。
FTH1阳性细胞数结果：与空白组和假手术组比较，模型组在1d、3d、7d各时间点FTH1阳性细胞数显著增多(P＜0.05)。与模型组比较，针刺组在1d、3d、7d阳性细胞数显著增多(P＜0.05)。
GPX4阳性细胞数结果：与空白组及假手术组比较，模型组在各时间点GPX4阳性细胞数均显著减少(P＜0.05)。与模型组比较，针刺组在各时间点GPX4阳性细胞数均较模型组显著增多(P＜0.05)。
6.免疫印迹检测结果：
NeuN蛋白表达结果：与假手术组比较，模型组大鼠在脑出血后1d、3d、7dNeuN蛋白表达显著减少（P＜0.05），3d减少达到高峰（P＜0.05），神经细胞死亡情况最重；7d有所恢复（P＜0.05）。与模型组比较，针刺组大鼠在脑出血后1d、3d、7dNeuN蛋白表达有所升高，结果具有显著性差异（P＜0.05）。针刺组与抑制剂组大鼠神经元细胞NeuN蛋白表达在各时间点比较，无显著性差异（P＞0.05）。
P62蛋白表达结果：与空白组及假手术组比较，模型组在脑出血后1d、3d、7d时间点P62蛋白表达均明显升高（P＜0.05）。模型组6h与1d、3d、7d比较，具有显著性差异（P＜0.05）。模型组3d与7d比较，无显著性差异（P＞0.05）。P62蛋白表达在脑出血后1d开始升高，3d达到高峰，7d维持在高峰。与模型组相比，针刺组在各时间点P62蛋白表达均明显升高（P＜0.05）。
Nrf2蛋白表达结果：与空白组和假手术组比较，模型组在各个时间点Nrf2蛋白表达均明显升高（P＜0.05）。模型组6h与1d、3d、7d时Nrf2蛋白表达比较，模型组3d与7d比较,均具有显著性差异（P＜0.05）。模型组6h Nrf2蛋白表达开始升高，3d达到高峰，7d下降。与模型组比较，针刺组在出血后6h、1d、3d显著增加了Nrf2的蛋白表达（P＜0.05）；在7d时针刺组Nrf2的蛋白表达较模型组明显减少（P＜0.05）。
Keap1蛋白表达结果：与空白组和与假手术组比较，模型组在脑出血后1d、3d、7d时Keap1蛋白表达均显著减少（P＜0.05）。模型组6h与1d、3d、7d时Keap1蛋白表达比较，具有显著性差异（P＜0.05）。模型组1d Keap1蛋白表达下降明显，3d下降达到高峰，7d有所升高。与模型组比较，针刺组在各时间点Keap1的蛋白表达均显著减少（P＜0.05）。
GPX4蛋白表达结果：与空白组和与假手术组比较，模型组GPX4蛋白表达在不同时间点均显著降低（P＜0.05）；模型组6h与1d、3d、7d比较，具有显著性差异（P＜0.05）。模型组1d时GPX4开始下降，3d时降低达到高峰，7d时GPX4蛋白表达有所升高。与模型组比较，针刺组在6h、1d时GPX4蛋白表达无显著性差异（P＞0.05），在3d、7d时针刺组GPX4的蛋白表达显著升高（P＜0.05）。
FTH1蛋白表达结果：与空白组及假手术组比较，模型组在各时间点FTH1蛋白表达均明显升高（P＜0.05）。模型组6h与模型组1d、3d比较，具有显著性差异（P＜0.05）。模型组6hFTH1蛋白表达开始升高，1d继续升高，3d达到高峰。与模型组相比，针刺组在1d、3d、7d时间点FTH1蛋白表达均明显升高（P＜0.05）。
结论：
1.“百会”透“曲鬓”针刺法可明显改善脑出血大鼠模型神经功能缺损及肢体运动功能。
2.“百会”透“曲鬓”针刺法可以明显改善脑出血大鼠脑组织病理形态，降低出血脑组织游离铁含量，脂质过氧化产物MDA含量，改善出血脑组织线粒体超微结构，抑制脑出血大鼠脑组织神经细胞铁死亡的发生，起到脑保护作用。
3.“百会”透“曲鬓”针刺法可激活“P62/keap1/Nrf2”信号通路，明显上调P62、下调keap1的蛋白表达，促进p62与keap1之间的相互作用，促进Nrf2的入核增多，从而增强细胞抵抗脂质过氧化损伤能力。
4.“百会”透“曲鬓”针刺法可能通过促进Nrf2的入核增多，一方面上调了FTH1蛋白表达，促进游离铁的储存和再利用，减少过氧化产物的产生；另一方面上调了GPX4蛋白表达，增加了过氧化产物的清除，抑制出血大鼠脑组织铁死亡脂质过氧化损伤过程，起到脑保护作用。