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绿盲蝽Apolyguslucorum是华北乃至全国棉区的主要害虫,严重危害多种经济作物,红颈常室茧蜂Peristenus spretus是其优势寄生性天敌,可有效控制绿盲蝽的危害。然而到目前为止,关于红颈常室茧蜂的报道多集中在其形态特征描述、寄主种类调查以及生殖生物学等,其生殖相关基因及调控机制尚不明确。前期研究发现,热激蛋白83(Heat Shock Protein 83,HSP83)在红颈常室茧蜂卵巢内的表达水平较高,推测HSP83可能在红颈常室茧蜂的繁殖调控中发挥着重要作用。HSP83属于HSP90蛋白家族,是真核生物生长发育所必需的分子伴侣。本论文首次克隆了红颈常室茧蜂的hsp83,利用免疫荧光染色研究了热激对卵子发生和卵巢发育的影响,并采用RNAi和热激手段分析了 hsp83在红颈常室茧蜂生殖调控过程中的作用。研究结果有利于明确hsp83对红颈常室茧蜂繁殖调控机制,为其生物防治尤其是田间释放体系的构建奠定理论基础。主要结果如下:1.获得了红颈常室茧蜂HSP83蛋白的基因全长并对其进行分析。通过质谱测序获得氨基酸序列,在保守区域设计简并引物,克隆Pshsp83片段,并通过RACE技术获得红颈常室茧蜂热激蛋白家族HSP83 cDNA全长(Pshsp83,登录号:MK165459)。该基因cDNA序列全长2772 bp,开放阅读框长度为2175 bp,共编码724个氨基酸,预测分子量为83.4 kDa,理论等电点为4.87。该基因全长的获得为抗体合成及其功能探究奠定了基础。2.利用荧光定量PCR(qPCR)技术对红颈常室茧蜂不同日龄和不同高温胁迫下Pshsp83的表达水平进行研究。结果显示,Pshsp83在不同日龄的红颈常室茧蜂体内表达量不同,羽化后1、3、5、7、9、11d和13 d该基因在红颈常室茧蜂体内均有表达,第13 d表达量达到最高。同时,测定了高温对Pshsp83表达量的影响。研究发现,35℃C高温胁迫条件下热激1 h,P hsp83表达量达到最高,显著高于在其他温度处理时的表达量。其余各温度条件下(26℃、29℃、32℃和38℃),Pshsp83表达量和对照(23℃C)相比无显著差异。3.合成抗体并利用该抗体对HSP83蛋白进行亚细胞定位。选取ELFDEMAEDKENYK作为抗原多肽并制备红颈常室茧蜂HSP83的多克隆抗体,皮下多点注射新西兰大白兔4次免疫,动脉取全血获得多克隆抗体,ELISA测定效价发现,获得的最终抗体效价,兔子A≥256 K,兔子B≥512 K,兔子C≥512 K,兔子D≥512 K。利用免疫荧光染色对抗体特异性进行检测,结果显示,兔子B中获得的抗体特异性较高,能够较好与HSP83蛋白结合;HSP83蛋白定位结果显示,该蛋白在红颈常室茧蜂整个卵巢管均有表达,在生长中的卵泡细胞表达量较多,生殖区表达量较少,35℃C热激后HSP83蛋白在红颈常室茧蜂卵巢中表达量显著高于23℃C(对照)处理的表达量,该结果与qPCR结果一致。4.红颈常室茧蜂卵巢内HSP83的功能初探。采用RNAi和热激的方法研究hsp83在红颈常室茧蜂生殖调控中的功能。首先,体外合成Pshsp83 dsRNA(404 bp),采用显微注射的方法将Pshsp83 dsRNA导入红颈常室茧蜂雌蜂体内,利用实时荧光定量PCR技术检测靶标基因Pshsp83的表达水平,观察其对红颈常室茧蜂繁殖指标的影响。结果表明,与对照(注射gfp dsRNA)处理相比,注射目标dsRNA后,雌蜂体内Pshsp83表达水平下降了 21.8%,而雌蜂寿命、后代雌雄比例及后代羽化率等参数未有显著变化。同时,采用热激法,探究了热激(35℃C)对红颈常室茧蜂生殖功能的影响。结果显示,与对照组(23℃)相比,热激后红颈常室茧蜂体内Pshsp83表达量显著升高,雌蜂寿命延长了 5 1%。可见,温度对红颈常室茧蜂Pshsp83表达水平有显著影响,热激(35℃C)对其生殖相关参数有一定影响。