【摘 要】
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葡萄(Vitis)因其突出的经济和社会价值被广泛栽培,如今,无核葡萄逐渐成为世界葡萄生产及消费的发展趋势,同时无核葡萄也是当下葡萄育种的主要目标。但目前无核葡萄的育种进展缓慢,分子机制还不够明确,这对无核葡萄的育种工作造成了一定的困难。分子生物学对于研究葡萄无核机理有重要作用,无核葡萄相关基因的挖掘对加速无核葡萄育种具有重要意义。本试验以葡萄品种‘维多利亚’及其无核芽变为试材,观察二者的花器官和果
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葡萄(Vitis)因其突出的经济和社会价值被广泛栽培,如今,无核葡萄逐渐成为世界葡萄生产及消费的发展趋势,同时无核葡萄也是当下葡萄育种的主要目标。但目前无核葡萄的育种进展缓慢,分子机制还不够明确,这对无核葡萄的育种工作造成了一定的困难。分子生物学对于研究葡萄无核机理有重要作用,无核葡萄相关基因的挖掘对加速无核葡萄育种具有重要意义。本试验以葡萄品种‘维多利亚’及其无核芽变为试材,观察二者的花器官和果实的性状差异,测定花粉萌发率,并对花粉进行细胞学观察与形态学观察。并通过对转录组数据的筛选和分析,挖掘与无核相关的基因。研究的主要结果如下:1.通过对‘维多利亚’无核芽变及‘维多利亚’的花器官和成熟果实的表型进行观察,以及通过对两种植株的果实及叶片等性状进行调查,发现‘维多利亚’无核芽变植株的花药干瘪,盛花期的无核芽变植株花穗的花帽不脱落,且成熟果实无核,这一性状由花粉败育导致,果实无核也会导致果实的体积和重量发生变化。2.通过对‘维多利亚’及其无核芽变植株的花粉进行花粉萌发率测定,发现在相同环境下培养4 h后,‘维多利亚’的花粉能够正常萌发,且萌发率在86.6%,而‘维多利亚’无核芽变植株的花粉萌发率为0。由此可见,‘维多利亚’无核芽变植株的花粉萌发率远远低于‘维多利亚’,可以确定‘维多利亚’无核芽变植株的花粉在发育过程中出现异常,导致花粉不能正常萌发。3.对两种材料两个时期的花粉进行细胞学形态观察,发现无核芽变植株的花粉绒毡层提前降解,无法继续为小孢子提供足够的养分,进而影响花粉发育。并对‘维多利亚’及‘维多利亚’无核芽变植株的成熟花粉进行了扫描电子显微镜的观察,发现‘维多利亚’无核芽变植株中成熟花粉的萌发沟较‘维多利亚’窄且浅,这也是影响花粉的育性的原因之一。4.通过整理和分析转录组数据,发现在本研究中,转录组测序共生成了729961224条raw reads,去除低质量片段后得到713847698条clean reads,各样品的reads与参考基因组的比对效率在89.22~94.05%之间,并且唯一比对位置的数量均达到87.23%以上。在VBFL vs VFL比较组合中,共有1455个差异基因,其中包括725个上调基因,730个下调基因。在VBFR vs VFR比较组合,共有6416个差异基因,其中2866个基因上调表达,3550个基因下调表达。以上差异基因主要富集在类黄酮生物合成、植物的昼夜节律、光合生物的固碳作用、甘油磷脂代谢等通路中。通过后续分析筛选,将类黄酮生物合成通路和苯丙烷生物合成通路确定为与花粉发育相关的关键通路。5.通过对类黄酮生物合成通路和苯丙烷生物合成通路的筛选,共得到24个候选基因,对其中12个基因(VIT_01s0010g03720、VIT_03s0180g00260、VIT_15s0048g02450、VIT_16s0039g01360、VIT_16s0200g00840、VIT_16s0039g01240、VIT_18s0001g01140、VIT_16s0100g00840、VIT_16s0039g01280、VIT_16s0100g00920、VIT_16s0100g01040和VIT_09s0002g04460)进行了q RT-PCR验证,结果发现这些基因与转录组数据的趋势一致。6.对VIT_16s0100g00920、VIT_03s0180g00260、VIT_15s0048g02450和VIT_01s0010g03720这4个基因进行克隆及后续分析,结果发现VIT_15s0048g02450(COMT)与VIT_01s0010g03720(4CL)两个基因在克隆得到的序列中无差异;在基因VIT_03s0180g00260(CAD)的碱基差异共有54处,均为纯杂合位点,且杂合情况全部发生在‘维多利亚’品种中。VIT_18s0072g00920(STS)在序列上存在的碱基差异较少,只有7个碱基发生改变,它们导致了3个氨基酸的变化。
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