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鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)是威胁水禽养殖业健康发展的重要病原之一,可引起鸭、鹅等多种水禽发病死亡。目前对DEV的研究取得了诸多进展,但主要在病毒基因组和蛋白质组上,其致病机理尚未完全清楚。众所周知,病毒的致病过程实质上是病毒与宿主间相互作用过程,不仅涉及到分子、细胞和器官上的变化,而且存在时间与空间上的动态变化。核转录因子κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路是动物机体中的一条重要途径,可以从转录水平影响多种基因的表达,在细胞分化、免疫应答和炎症反应等方面能发挥至关重要作用。但有关NF-κB信号通路对DEV增殖过程中的作用及其机制尚未清楚。因此,本文拟在前期研究基础上,开展DEV感染对宿主细胞NF-κB信号通路的影响研究,以期为阐明DEV致病机理提供一定的基础数据。研究内容包括:1.NF-κB基因在感染鸭机体组织中的转录表达研究采集健康对照鸭和DEV感染96h鸭的组织样本,提取组织mRNA,根据GenBank公布的鸭NF-κB基因和GAPDH基因的核苷酸序列设计特异性引物,以GAPDH基因作为内参,采用实时荧光定量PCR法检测NF-κB基因的转录水平,结果:在健康鸭组织中,NF-κB基因的相对表达最高由高到低依次是胰腺(9.0571±3.8294)、脾脏(1.0096±0.1648)、肝脏(0.8149±0.1381)、胸腺(0.5479±0.0437)、气管(0.3759±0.0186)、十二指肠(0.2852±0.0430)、法氏囊(0.1797±0.0696)、肺脏(0.0436±0.0016)、心脏(0.0354±0.0054)、肾脏(0.0186±0.0054)、脑(0.0179±0.0015)和肌肉(0.0073±0.0022);在DEV感染鸭中,NF-κB基因的相对表达量由高到低依次是胰腺(33.3750±10.1016)、肺脏(1.1355±0.2798)、脾脏(1.0008±0.0492)、胸腺(0.7033±0.1315)、十二指肠(0.4423±0.1727)、法氏囊(0.3354±0.0780)、气管(0.2174±0.0442)、大脑(0.1497±0.1153)、肝脏(0.1017±0.0081)、心脏(0.0323±0.0051)、肾脏(0.0278±0.0047)和肌肉(0.0033±0.0007)。以上结果显示,DEV感染后能引起鸭组织中NF-κB基因转录水平发生不同程度的改变,其中转录水平显著上升的组织是胰腺,而下降最明显的是肝脏。这些变化对DEV致病过程有何影响,有待进一步研究。2.DEV感染对宿主细胞NF-κB信号通路的影响研究制备鸭胚成纤维细胞(DEF),接种DEV,在接种后1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h和120h时,收集细胞样本(包括细胞和培养细胞上清),提取细胞的总RNA,采用实时荧光定量PCR检测细胞NF-κB基因转录水平;收集细胞上清液,采用ELISA检测细胞上清中NF-κB信号通路相关分子含量,结果:在DEV感染细胞中,NF-κB基因的转录水平除了在60h~96h呈现显著提高之外,其余时间段与在正常细胞对照组中的转录水平无明显差异;在DEV感染细胞的上清中,NF-κB、MyD88、IL-1β、IL-8、IL-17、IL-32和TNF-α分泌量在不同时间段上呈现不同程度、无规律的变化,其中NF-κB分泌量在4h~12h、36h~72h和84h~120h呈现上升趋势,MyD88、IL-17和IL-32分泌量在84h~120h呈现上升趋势;而IL-1β、IL-8和TNF-α分泌变化无可循的规律性。这些NF-κB信号通路相关分子分泌变化对DEV增殖过程有何影响,有待进一步研究。3.NF-κB基因shRNA干扰重组质粒的构建与鉴定根据GenBank公布的NF-κB基因序列信息,设计4个不同shRNA序列,并插入到pGPU6/GFP/Neo载体中,筛选阳性重组质粒并进行测序鉴定,结果:阳性重组质粒可被BamHⅠ酶切得到与预期大小相一致的两条DNA片段;测序片段大小相应为882bp、928bp、997bp和1002bp。这些结果说明本研究成功构建了NF-κB基因的shRNA干扰重组质粒,为后期开展基于NF-κB基因干扰DEV增殖效果研究鉴定了基础。结论:NF-κB基因在正常鸭各个组织中具有不同程度的转录表达,DEV感染后其转录表达水平发生了一定的动态变化;ELISA法检测鸭胚成纤维细胞中NF-κB、MyD88、IL-1β、IL-8、IL-17、IL-32和TNF-α各时间段的表达有一定的差异;成功构建了针对NF-κB基因的shRNA干扰表达重组质粒。