论文部分内容阅读
前言卵巢癌是妇科死亡率最高的恶性肿瘤。卵巢癌的发生与发展是一个极其复杂的多因素过程,其发生机制一直是妇科肿瘤基础与临床研究探索的重点。随着研究的深入,人们发现在复杂的细胞活动中,除了DNA和蛋白质扮演了绝对重要的角色外,糖类物质同样起着相当重要的作用。细胞膜的脂双层外,几乎全部被一些糖蛋白或糖脂的糖链所覆盖,形成一层糖衣。这些糖蛋白通过不同方式镶嵌在或联接于细胞膜上,其外露的糖链部分对细胞-细胞、细胞-分子的识别十分重要,参与配体结合、信号转导、分子粘附等分子相互作用,与细胞生长、凋亡、运动、分化等重要生命过程密切相关,被称为细胞间的信使。研究表明,恶性肿瘤的恶性行为(恶性增殖、侵袭转移等)与肿瘤细胞表面糖复合物的组成、结构密切相关。肿瘤细胞表面结构异常的糖链可被机体的免疫系统视为非已外来物,从而成为肿瘤相关糖抗原(TACA)。细胞表面的TACA比任何蛋白质抗原都更为丰富,Lewis y抗原是其中一种,近年来受到研究者的广泛重视。Lewis y在许多恶性肿瘤中表达增高,而且与肿瘤的病理分期及预后密切相关。但其在卵巢癌发生、发展中的作用尚不十分清楚。我们利用基因转染技术将Lewis y抗原合成关键酶α1,2-岩藻糖转移酶(al,2-fucosyltransferase,α1,2-FT)基因转染入Lewis y抗原低表达卵巢癌细胞系RMG-I,建立Lewis y抗原高表达细胞系RMG-I-H,为探讨Lewis y高表达对RMG-I细胞增殖能力的影响及其发生机制提供了良好的工具。全文分下列两部分：第一部分卵巢癌细胞RMG-I Lewisy抗原与TGF-β及其受体相关性的研究目的探讨Lewis y抗原高表达对卵巢癌细胞RMG-I裸鼠体内致瘤性的影响及Lewisy抗原促进卵巢癌细胞生长增殖的机制。选择与Lewis y抗原密切相关的生长因子超家族成员转化生长因子β(TGF-β及其受体TβRⅠ与TβRⅡ为研究对象,探讨Lewis y抗原对TGF-β及其受体表达的影响,以及TGF-β1对Lewis y高表达卵巢癌细胞RMG-I-H增殖能力的影响,并检测Lewis y抗原与TβRⅠ及TβRⅡ的结构关系。方法建立裸鼠移植瘤模型,比较基因转染前后细胞裸鼠体内致瘤能力的变化。RealTime PCR方法及免疫组织化学方法检测Lewis y高表达对TGF-β1、TβRⅠ及TβRⅡ的表达的影响。MTT实验测定TGF-β1对Lewis y高表达卵巢癌细胞增殖能力的影响。免疫沉淀及Western Blot方法检测细胞TβRⅠ/Ⅱ与Lewis y抗原的结构关系及表达量,激光共聚焦显微镜观察二者的位置关系。结果1、Lewis y抗原表达增高能使卵巢癌细胞RMG-I成瘤时间提前,成瘤体积及重量均增加,Lewis y抗体处理后RMG-I-H的致瘤能力则明显下降。2、Lewis y抗原上调裸鼠移植瘤组织TGF-β1表达。3、TGF-β1以浓度依赖的方式促进Lewis y抗原高表达卵巢癌细胞RMG-I-H增殖。4、Lewis y抗原不改变细胞及裸鼠移植瘤组织中TβRⅠ表达,而上调TβRⅡ表达。5、免疫沉淀法显示,TβRⅠ和TβRⅡ均含有Lewis y结构,且RMG-I-H细胞表面TβRⅠ及TβRⅡLewis y表达均明显增加。6、利用激光共聚焦显微镜观察可见RMG-I-H细胞表面TβRⅠ和Ⅱ与Lewisy抗原共定位。结论Lewis y抗原提高RMG-I细胞的体内致瘤能力。Lewis y抗原与TGF-β1关系密切,Lewis y抗原上调TGF-β1表达,TGF-β1以浓度依赖的方式促进Lewis y高表达细胞株的增殖。TβRⅠ和TβRⅡ中均含有Lewis y结构,且RMG-I-H细胞TβRⅠ与TβRⅡLewis y抗原表达增加。第二部分Lewisy抗原对卵巢癌细胞RMG-I TGF-β介导的重要信号通路的影响目的在第一部分中发现Lewis y是TβRⅠ和TβRⅡ结构的一部分,且Lewis y在α1,2-FT基因转染后细胞TβRⅠ及TβRⅡ表达增加,那么细胞表面TβRⅠ和TβRⅡ结构的改变能不能进一步引起下游信号分子表达或者激活呢?这是本部分要解决的问题。方法Western Blot方法检测细胞TGF-p受体下游信号分子Smad2/3, Smad7, Akt1/2/3, MEK1/2及ERK1/2的表达及其磷酸化水平的变化,以及抗体处理后不同时间(1min,10min,30min) Smad2/3, Akt1/2/3及ERK1/2磷酸化水平的变化。结果1、Lewis y抗原不改变Smad2/3蛋白的表达,但下调p-Smad2/3表达、上调Smad7表达。2、TGF-p1能激活Lewis y抗原高表达卵巢癌细胞RMG-I-H ERK/MAPK和PI3K信号通路。3、Lewis y抗原不改变ERK1/2及MEK1/2的表达,但上调p-ERK1/2及p-MEK1/2表达。4、Lewis y抗原不改变Aktl/2/3的表达,但上调p-Akt1/2/3表达。5、p-ERK1/2、p-Akt1/2/3及p-Smad2/3表达均随Lewis y单克隆抗体处理时间延长而降低。结论Lewis y抗原通过调节TGF-β1依赖的Smad, ERK/MAPK及PI3K/Akt信号通路在促进卵巢癌细胞增殖中发挥重要作用。