【摘 要】
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胰蛋白酶（Trypsin,EC 3.4.21.4）是一种广泛存在于自然界中的丝氨酸蛋白水解酶,能够特异性的水解精氨酸或者赖氨酸的羧基末端,通过参与酶消化级联反应激活其他蛋白酶原,属肽链内切酶。灰色链霉菌胰蛋白酶（Strptomyces griseus trypsin,SGT）是一种细菌来源的胰蛋白酶,因为其三级结构和催化机制与牛（猪）源胰蛋白酶有较高的相似度,且本实验室前期已经实现了SGT成熟酶在
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胰蛋白酶（Trypsin,EC 3.4.21.4）是一种广泛存在于自然界中的丝氨酸蛋白水解酶,能够特异性的水解精氨酸或者赖氨酸的羧基末端,通过参与酶消化级联反应激活其他蛋白酶原,属肽链内切酶。灰色链霉菌胰蛋白酶（Strptomyces griseus trypsin,SGT）是一种细菌来源的胰蛋白酶,因为其三级结构和催化机制与牛（猪）源胰蛋白酶有较高的相似度,且本实验室前期已经实现了SGT成熟酶在毕赤酵母GS115中的可溶表达,故被认为是有望通过基因工程相关策略使其成为目前商品化胰蛋白酶的替代品。本论文围绕SGT的底物特异性改造以及提高SGT在毕赤酵母中的分泌水平进行研究,主要研究内容如下:（1）SGT的表达优化。首先基于Pichia pastoris GS115在甲醇诱导条件下的分泌组学数据改造α信号肽pre区,选取了七个高分泌水平的蛋白酶:FLO10、SCW11、GAS1、MSB2、DAN4、PHO5和EXG1,并对其pre-sequences进行预测,加上本实验室前期验证过的两条pre-sequences（SP1和SP4）,将α信号肽的pre-sequence置换为上述蛋白酶信号肽的pre-sequences,筛选结果显示FLO10效果最好,酶活由37.8 U·m L-1提高至59.8U·m L-1;随后又通过截短α信号肽pro区第57-70位氨基酸,以及C端融合HL28短肽,酶活进一步提高至62.9 U·m L-1;最后通过共表达信号肽加工蛋白Kex2和Ste13,进一步提高了SGT分泌效率,摇瓶酶活达到68 U·m L-1,酶活水平相较野生型α信号肽提高了1.8倍。（2）共进化策略提高SGT底物特异性及催化效率。选取60条不同来源的胰蛋白酶序列进行比对,分析各个位置的氨基酸进行出现频次,选择SGT序列中潜在的“热点”,将其定点突变为出现频次大于40的氨基酸。其中单点突变体A45S、V177I和E180M的酶活分别提高至75.3 U·m L-1、74.8 U·m L-1和77.2 U·m L-1;突变体T190S将底物催化比例（R/K）由4.1提高至7.5。接着我们对T190位点进行了饱和突变筛选和分子对接,饱和突变结果表明T190S为效果最好的突变体;分子对接结果显示S189与底物的作用力增强,S190与底物的作用力变弱,从而使得侧链较长的精氨酸底物更容易和突变体蛋白结合,造成了T190S对精氨酸底物的偏好性增加。（3）基于共进化策略迭代改造SGT及放大培养。我们对上述性能优良的单点突变体进行组合迭代突变,其中组合突变体A45S/V177I/E180M酶活提高最为明显,达到98 U·m L-1。引入T190S的组合突变体酶活均得到不同程度的下降,但是底物催化比例（R/K）均得到一定程度上的提高。其中组合突变体V177I/E180M/T190S底物催化比例最高为4.6,是对照菌株的1.1倍。同时我们还对组合突变体的比酶活和底物动力学相关参数进行了表征,整体比酶活的变化趋势基本与酰胺酶酶活变化趋势一致;组合突变体A45S/V177I/E180M催化效率最高,kcat/Km为1.21×106 s-1·m M-1,是对照菌株的13.7倍;底物催化比例（R/K）最高的组合突变体V177I/E180M/T190S比酶活为1698 U·mg-1,其Km值有所增加,即与底物的亲和力下降,但底物催化效率升高,整体催化能力略高于对照菌株FLO10。在对组合突变体A45S/V177I/E180M的结构分析中,我们发现其催化三联体中H57和D102之间的距离由7.0（?）缩短至6.4（?）,加快其催化过程中质子传递的速率,可能是性能提高的原因之一;在分析其Ca2+结合相互作用力时,V177I和E180M这两个单点突变的引入,加强了该突变体与Ca2+的结合作用力,可能是性能提高的原因之二。最后我们在3-L罐水平上对这两株组合突变株进行分批补料发酵,其中组合突变体V177I/E180M/T190胞外酰胺酶酶活最终达到460 U·m L-1;另一株组合突变体A45S/V177I/E180M胞外酰胺酶酶活进一步提升至2506 U·m L-1,为目前报道最高水平。综上的研究为SGT的工业化生产和胰岛素的制备奠定了良好的基础。
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