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目的:1.构建阴部神经挤压伤(PNC)压力性尿失禁(SUI)大鼠模型,采用阴部神经电刺激对SUI大鼠模型进行干预,在体研究阴部神经电刺激治疗对SUI的疗效,并在组织水平探讨阴部神经电刺激对大鼠阴部神经及尿周组织的影响。2.构建盐桥系统直接电刺激细胞模型、力学加载损伤大鼠背根神经节DRG细胞模型、DRG细胞与大鼠坐骨神经施万细胞RSC96细胞共培养模型,研究电刺激对DRG细胞的作用以及RSC96细胞源性外泌体在这一过程中的可能作用及相关机制。材料和方法:第一部分:将60只SD雌性未孕未产大鼠随机分为四组:对照组(CON):无任何干预;假手术组(Sham):仅手术分离出阴部神经,不进行任何其他处理即缝合肌肉和皮肤;损伤组(PNC):手术分离出双侧阴部神经,分别使用微型镊钳夹两侧阴部神经各三次,每次持续30秒,每间隔5秒钳夹一次;治疗组(PNC+ES):PNC造模完成1小时后,使用自制电极针给予双侧阴部神经受损近端1小时的电刺激。以上四组大鼠每组各15只。各组大鼠均在造模7天后行喷嚏试验与尿流动力学检查(包括最大膀胱容量MBC和漏尿点压力LPP)来评估阴部神经电刺激对SUI的疗效。随后处死大鼠,取阴部神经组织及尿道膀胱颈周围组织标本,使用Masson三色染色观察尿周组织肌肉及胶原的变化,使用HE染色观察阴部神经损伤及修复状况。第二部分:(1)通过盐桥细胞直接电刺激装置对大鼠背根神经节DRG细胞进行细胞电刺激干预(电刺激大小100m V/mm、200m V/mm,时间0.5h、1h、2h),检测DRG细胞的活性(CCK-8法)、细胞衰老发生率(β半乳糖苷酶染色法)、细胞凋亡(Hoechst染色法)的改变,以此评估最佳DRG细胞电刺激参数。(2)进一步通过循环力学加载(CMS)(5333μstrain,8 h,1 Hz)构建DRG细胞损伤模型,联合DRG细胞电刺激模型,检测各模型组DRG细胞活性(CCK-8法,Ed U染色法)、细胞周期(PI染色流式细胞术)、细胞凋亡(Annexin V/PI双标法)的改变,研究适宜参数电刺激对损伤后的DRG细胞的影响。(3)通过Transwell 0.4μm孔径膜的六孔板构建DRG细胞与RSC96细胞共培养模型,联合CMS诱导的DRG细胞损伤模型与细胞电刺激模型,检测各模型组中DRG细胞活性(CCK-8法)与细胞凋亡(Annexin V/PI双标法)的改变,研究RSC96细胞在电刺激影响DRG细胞过程中的间接作用。第三部分:(1)使用谷氨酸检测试剂盒检测电刺激对DRG细胞分泌谷氨酸的影响,并通过透射电镜及流式细胞术(游离钙离子探针Fluo-4 AM)检测谷氨酸对RSC96细胞外泌体分泌以及细胞内钙离子浓度的影响。同时,使用NMDA离子型谷氨酸受体抑制剂MK801抑制谷氨酸的作用,研究谷氨酸、细胞内钙离子浓度与RSC96细胞外泌体分泌过程中的相互关系。(2)在电刺激后的正常/损伤DRG细胞与RSC96细胞的共培养体系中,使用外泌体分泌抑制剂GW4869,检测各组DRG细胞活性及凋亡的改变,研究RSC96细胞源性外泌体在RSC96细胞间接影响电刺激后DRG细胞过程中的作用。(3)提取RSC96细胞源性外泌体对DRG细胞进行干预,检测各组DRG细胞周期(PI染色流式细胞术)及Wnt/β-catenin通路相关蛋白(Western blot、RT-PCR)的改变。(4)联合使用Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939和RSC96细胞源性外泌体处理DRG细胞,检测DRG细胞活性、细胞周期、细胞凋亡以及下游蛋白的改变,探究Wnt/β-catenin通路在RSC96源性外泌体影响DRG细胞过程中的作用。结果:第一部分:(1)与CON组大鼠比较,Sham组大鼠喷嚏试验阳性率、MBC值和LPP值均无明显差异(P>0.05);PNC组大鼠MBC值与LPP值明显降低(P<0.001),喷嚏试验阳性率明显增加(P<0.001)。与PNC组相比,经过阴部神经电刺激治疗后,大鼠MBC值和LPP值明显回升(P<0.001),喷嚏试验阳性率下降(P<0.05)。(2)阴部神经HE染色结果显示,CON组与Sham组神经纤维排列整齐,走形一致,无曲折和牵拉离断现象,PNC组阴部神经走形紊乱,有明显的神经缺损与离断现象,部分神经纤维之间排列稀疏。与PNC组相比,PNC+ES组大鼠阴部神经可见明显的神经修复痕迹,神经组织大部分愈合,少部分神经未完全愈合。(3)膀胱颈尿道交界部组织Masson三色染色结果显示,CON组和Sham组大鼠膀胱颈尿道交界部组织结构完整,周围包裹完整厚实的肌肉组织,肌肉组织间隙充满致密纤长的胶原纤维。而PNC组中肌肉稀疏,出现明显缝隙,肌肉横截面积减小,有失神经支配后表现,胶原纤维也有轻度的减少。经阴部神经电刺激治疗后,尿周组织肌肉恢复良好,胶原纤维含量有所增加。第二部分:(1)与未电刺激组相比,在100m V/mm与200m V/mm的电刺激作用下,DRG细胞活性均随着时间的延长(0h、0.5h、1h、2h)呈现出先上升后下降的变化,DRG细胞衰老率与凋亡细胞数呈现出先降低后升高的变化。在100m V/mm 1 h的电刺激参数下,DRG细胞的活性最高、细胞衰老发生率与凋亡细胞数最低。(2)与对照组细胞(正常DRG细胞)相比,电刺激组(对正常DRG细胞进行100m V/mm 1 h的电刺激处理)细胞活性明显增加(P<0.001),G2期细胞明显增多(P<0.001),细胞总凋亡率明显下降(P<0.001);而损伤组(CMS诱导的损伤后DRG细胞)细胞活性明显降低(P<0.001),S期细胞比例增加(P<0.001)、G2期细胞比例减少(P<0.05),细胞总凋亡率明显升高(P<0.001)。同时,与CMS组相比,治疗组(CMS+ES组,对损伤后的DRG细胞进行100m V/mm 1 h的电刺激处理)细胞活性明显回升(P<0.001),S期的细胞数量减少(P<0.001)、G2期细胞增多(P<0.01),细胞总凋亡率明显下降(P<0.001)。(3)无论是正常DRG细胞还是CMS诱导的损伤后DRG细胞,与电刺激组(仅对正常/损伤的DRG细胞进行电刺激处理)相比,共培养组(正常/损伤的DRG细胞电刺激后再与RSC96细胞共培养)细胞活性明显增加(P值均<0.001),细胞总凋亡率明显下降(P<0.001,P<0.01)。第三部分:(1)电刺激组的DRG细胞在电刺激完成后的每个时间点(4 h、6h、8 h、10 h、12 h)所检测的谷氨酸浓度均高于非电刺激组,且差异有统计学意义(P<0.001),且在电刺激完成后6-8小时,DRG细胞分泌谷氨酸达到高峰。当给予RSC96细胞外源性谷氨酸(50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)处理时,结果显示,与对照组相比,谷氨酸各浓度组外泌体分泌数量均明显增多(P值均<0.001)、RSC96细胞内钙离子浓度均明显增加(P<0.05,P<0.001,P<0.01),且在浓度为100μmol/L时外泌体的分泌量最多、细胞内钙离子浓度最高。MK801通过抑制NMDA离子型谷氨酸受体降低细胞内钙离子浓度,在MK801的存在下,由谷氨酸诱导的RSC96细胞的外泌体分泌明显减少(P<0.001)。(2)对正常/损伤的DRG细胞,当在共培养体系中加入外泌体分泌抑制剂GW4869后,DRG细胞的活力明显较无抑制剂组降低(P值均<0.001),细胞总凋亡率升高(P值均<0.001)。(3)与未加入RSC96细胞源性外泌体组(Con组和CMS组)相比,外泌体处理后的正常/损伤DRG细胞(Exo组和CMS+Exo组)S期细胞明显减少(P值均<0.001),G2期细胞明显增多(P值均<0.001)。Wnt/β-catenin通路相关蛋白检测结果显示,与Con组相比,Exo组DRG细胞内β-catenin与p-GSK3β表达增加,GSK3β表达下降,C-myc与cyclin D1表达增加,均有统计学差异(P值均<0.001);CMS组细胞内β-catenin与p-GSK3β表达下降,GSK3β表达增加,C-myc与cyclin D1表达下降,差异均有统计学意义(P值均<0.001)。当给予CMS组细胞外泌体处理后,与CMS组相比,DRG细胞内β-catenin与p-GSK3β表达增加,GSK3β表达下降,C-myc与cyclin D1表达增加(P值均<0.001)。(4)对正常/损伤DRG细胞,单独给予Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939,细胞活力、细胞周期及细胞凋亡发生情况的改变无统计学差异(P值均>0.05)。而与单独给予外泌体组相比,同时给予外泌体及XAV939时,正常/损伤DRG细胞活性明显降低(P<0.001,P<0.05),S期细胞比例增多(P值均<0.01)、G2期细胞比例减少(P<0.001,P<0.01),细胞总凋亡率增加(P值均<0.001)。对Wnt/β-catenin通路下游蛋白检测发现,对正常的DRG细胞,单独给予抑制剂XAV939对Cmyc、cyclin D1、Bcl-2、Bax的表达均无影响(P值均>0.05),但对于CMS细胞,单独给予XAV939会导致C-myc、cyclin D1、Bcl-2蛋白表达量减少(P值均<0.001),Bax蛋白表达增加(P<0.001)。与外泌体组相比,同时给予外泌体及抑制剂XAV939时,正常/损伤DRG细胞C-myc、cyclin D1、Bcl-2蛋白的表达下降(P值均<0.001),Bax蛋白的表达增加(P<0.001)。结论:1.阴部神经损伤是压力性尿失禁发生的重要病因,阴部神经电刺激能显著改善阴部神经挤压伤造模压力性尿失禁大鼠的尿动力功能,修复损伤后的阴部神经及尿周肌肉与胶原组织。2.盐桥系统细胞直接电刺激模型能有效建立DRG细胞电刺激模型,且100m V/mm 1 h的电刺激参数可作为电刺激DRG细胞最合适的参数用于体外细胞电刺激研究。同时,电刺激可以促进正常或损伤后DRG细胞活性增加,减少细胞凋亡发生,且将电刺激后的DRG细胞与RSC96细胞共培养可进一步的促进DRG细胞活性,减少细胞凋亡。3.电刺激能促进DRG细胞分泌谷氨酸,而谷氨酸可通过增加RSC96细胞内钙离子浓度进而促进外泌体的分泌,RSC96细胞分泌的外泌体能反馈作用于DRG细胞,激活DRG细胞内的Wnt/β-catenin信号通路,提高细胞活性、减少细胞凋亡发生、促进细胞周期进程,进而实现对损伤后DRG细胞的修复作用。