研究背景唐氏综合征,也叫做21三体综合征,是一个由染色体的拷贝数异常而引发的遗传性疾病,主要表现为病患的基因组中,21号染色体出现部分的或者整体的三倍化。该病是新生儿中最为常见的染色体异常疾病,发病率约为1/600-800,孕中期及后期可以通过胎儿染色体核型分析等多种方法检测。唐氏综合征患者在生长发育的过程中存在智力低下、认知障碍、发育迟缓、特殊面容以及多发畸形等典型症状,目前无有效的缓解或治疗手段。双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)基因,位于人类21号染色体的唐氏综合征关键区域(Down Syndrome critical region,DSCR)。该基因编码一个双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶(DYRK)家族成员。DYRK1A包含5个主要区域,包括一个N端的核定位信号(NLS),一个激酶活性区(Kinase Domain),一个有高含量的脯胺酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸(PEST)区、一个13个组氨酸重复序列的高度保守区以及一个富含丝、苏氨酸的区域。DYRK1A可以催化自体丝、苏氨酸和酪氨酸磷酸化,不仅参与大脑的发育,在调控细胞增殖的细胞通路中也具有重要作用,是唐氏综合征(DS)的重要候选基因之一。研究显示,DYRK1A会引起果蝇幼虫大脑神经母细胞畸形,提示DYRK1A可能参与调节神经发育。敲入DYRK1A的小鼠会有显著的神经发育延迟、神经轴异常、精神迟钝和认知学习障碍,Dyrkla过量表达会抑制小鼠神经细胞增殖促并促进发育中的大脑皮层早熟神经元分化。因此,对DYRK1A的表达调控机制研究对探索神经退行性疾病的发病及治疗意义重大。肌细胞特异增强子2(MEF2)是一类重要的转录因子,不仅调控肌细胞的功能,对神经元分化和神经发育亦具有重要作用。MEF2家族成员会有选择性的表达在有丝分裂期后新生成的神经元中,进而参与调节该类神经元的活性及存活。MEF2D是MEF2家族成员之一,大量研究提示其对神经生成、神经元分化和存活具有重要意义。本课题第一次在神经胶质瘤细胞中探索MEF2D对DYRK1A的基因调控机制,以及DYRK1A和MEF2D之间的相互作用。本课题的结果对进一步探寻神经退行性疾病的发病机制及治疗提供理论基础。第一部分MEF2D对DYRK1A的转录调控研究目的研究DYRK1A不同异构体在神经胶质瘤细胞系中的特异性表达情况,以及MEF2D对DYRK1A不同异构体的转录调控,明确其分子调控机制,并进一步探索MEF2D对DYRK1A的调控作用与神经发育之间的关系。研究方法1.在人脑胶质瘤T98G细胞系中研究转录因子MEF2D对DYRK1A基因不同异构体的转录调控。应用LipofectamineTM2000分别将MEF2D表达质粒pCMV6-entry-MEF2D及空白对照质粒转染入T98G细胞,48小时后将细胞收集起来,应用TRIzol法提取细胞中的RNA,并使用Takara PrimeScriptTM逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录为cDNA,进一步通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测内源性DYRK1A mRNA不同异构体的表达变化;应用SYBR Green法实时荧光定量PCR(Real-time RT-PCR)法再次检测DYRK1A不同异构体的表达情况并进行分析。2.MEF2D对DYRK1A启动子活性调控。2.1 DYRK1A启动子质粒的构建:利用PCR技术从提取的人类基因组中扩增DYRK1A的启动子序列,并将其克隆到无启动子活性的pGL3-Basic载体中,或者启动子质粒pDYluc-long;2.2 MEF2D高表达及敲除siRNA效果检测。应用LipofectamineTM2000将MEF2D表达质粒及敲除siRNA分别与空白对照转染入T98G细胞,转染后48小时收集细胞并裂解,蛋白定量后应用Western Blot检测MEF2D以及DYRK1A的表达变化,β-ACTIN作为内参;2.3 应用 LipofectamineTM2000 将 pCMV6-entry-MEF2D 及空白对照质粒、MEF2D敲除siRNA及空白对照分别与pDYluc-long及pGL3-Basic质粒转染入HEK293细胞,48小时后裂解细胞并应用Luciferase Assay技术检测启动子活性。3.寻找并确认DYRK1A启动子功能性DY-MRE(MEF2D responsive element)位点。3.1 MEF2D 结合位点预测:http://jaspar.genereg.net/网站中输入 DYRK1A启动子区序列,预测MEF2D的可能结合位点;3.2分别构建含有DYRK1A启动子不同区域截短体的荧光素酶载体,应用LipofectamineTM2000将pCMV6-entry-MEF2D及空白对照质粒分别与不同截短体载体及pGL3-Basic质粒共转染HEK293细胞,48小时候收集细胞并裂解,应用Luciferase Assay分析不同截短体在MEF2D作用下的启动子活性变化;3.3构建包含预测DY-MRE的载体及对应的突变载体,转染HEK293细胞并通过Luciferase Assay再次确认MRE的活性;3.4根据预测位点设计荧光探针,应用凝胶电泳迁移率实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)在体外验证 DY-MRE 与 MEF2D蛋白的结合;进一步用染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)试验确认功能性的DY-MRE位点在体内与转录因子MEF2D的特异结合,同时应用Immunoprecipitation及Western Blot确认anti-MEF2D抗体可以特异的与MEF2D蛋白结合并进行有效沉淀。4.在动物模型中研究MEF2D与DYRK1A之间的关系。分别取胚胎期为13.5 天(E13.5)、18 天(E18)及出生后 1、7、14 天(P0,P7,P14)的多只小鼠的大脑皮层,应用TRIzol法提取组织中的RNA,进一步应用Takara PrimeScriptTM反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,结合SYBR Green法实时荧光定量检测样本中MEF2D及总DYRK1A的mRNA表达情况。5.在神经胶质瘤T98G细胞中验证MEF2D对DYRK1A的作用。应用LipofectamineTM2000 将 pNFATc2 表达质粒分别与 pCMV6-entry-MEF2D 及对照质粒共转,转染后48小时收取并裂解细胞,应用Western blot检测MEF2D高表达时,升高的DYRK1A对NFATc2的作用;同时将pNFATc2表达质粒分别与pCMV6-entry-DYRK1A及对照质粒共转作为阳性对照。6.统计分析:应用SPSS 17.0软件对数据进行处理,并且采用t检验和Sperman相关分析对得到的结果做差异性分析处理,P<0.05代表获得的差异具有统计学意义。研究结果1.MEF2D可以特异性上调DYRK1A的mRNA总量及DYRK1A isoform 5的表达量,对DYRK1A isoform 2,3的mRNA表达量并无影响。T98G以及HEK293细胞中可以检测到DYRK1A isoform 1和5以及MEF2D的蛋白表达。2.MEF2D通过增强DYRK1A isoform 5的启动子活性上调DYRK1A mRNA的表达。2.1 MEF2D高表达后显著上调DYRK1A启动子活性;2.2 MEF2D被敲减后,DYRK1A启动子活性与对照相比显著降低。3.DYRK1A基因启动子上MEF2D功能性位点DY-MRE的确定。3.1通过Jaspar网站对DYRK1A启动子区域序列进行分析,获得可能的MEF2D结合位点;3.2双荧光素酶报告基因检测方法检测DYRK1A启动子不同区截短体质粒在MEF2D高表达时启动子活性的变化。结果发现包含-442～-254 bp位点的启动子活性可以被MEF2D上调,通过Jaspar序列分析发现,该区域包含一个可能的功能性MEF2D结合位点,位于-268～-254 bp;3.3分别构建包含-268～-254 bp及对应突变的启动子载体,结合双荧光素酶报告基因检测方法证实该段区域启动子活性可被MEF2D特异性上调,关键碱基突变后,MEF2D对启动子活性的上调作用消失;3.4通过EMSA和ChIP的方法确认功能性DY-MRE位点位于-268～-254 bp。4.DYRK1A与MEF2D在正常小鼠大脑神经发育过程中mRNA表达呈正相关性。当MEF2D表达较高时,DYRK1A表达水平也相应较高,而当MEF2D表达量较低时,DYRK1A的表达量随之降低,通过斯皮尔曼相关系数计算证实p=0.0478,r=0.6182。结果提示MEF2D与DYRK1A在大脑的神经发育过程中可能存在协同作用。5.在T98G细胞中DYRK1A过量表达可以显著性降低NFATc2的蛋白表达水平。MEF2D在mRNA及蛋白水平均可以升高DYRK1A的表达,并通过DYRK1A进一步降低NFATc2的表达水平。结论1.MEF2D可以特异性上调人DYRK1A isoform 5的转录。2.人DYRK1A基因启动子活性可被MEF2D上调,-268～-254 bp处的DY-MRE位点可与MEF2D特异性结合,激活DYRK1A的启动子活性。3.MEF2D与DYRK1A在正常小鼠的大脑皮层神经发育过程中,mRNA的表达量呈正相关性。4.在神经胶质瘤细胞系中,MEF2D通过特异性上调DYRK1A的表达降低NFATc2的蛋白表达量。第二部分DYRK1A对MEF2D的磷酸化修饰及功能影响研究目的研究双底物特异性酪氨酸磷酸化调节激酶A(DYRK1A)对转录因子MEF2D的磷酸化修饰,探寻修饰位点及作用机制,明确MEF2D磷酸化修饰对其功能的影响。研究方法1.在人胚肾HEK293细胞研究DYRK1A对MEF2D的磷酸化作用。应用LipofectamineTM2000 将 pCMV6-entry-MEF2D 表达质粒分别与 pCMV6-entry-DYRK1A表达质粒及空白对照质粒共转染入HEK293细胞,转染后48小时收集并裂解细胞,应用Western Blot检测MEF2D的表达情况。2.通过质谱检测,寻找并分析MEF2D蛋白被DYRK1A磷酸化的位点。2.1构建MEF2D的原核表达载体。MEF2D表达序列全长521个氨基酸,将其克隆入pET32a(+)载体中,得到pET32a-MEF2D质粒,测序验证其正确表达;2.2将构建好的pET32a-MEF2D转化入感受态BL21细胞中进行原核扩增,并应用适当浓度的IPTG过夜诱导,收集菌体并进行过Ni-NTA柱纯化;2.3对纯化后的蛋白进行BCA法蛋白定量,并应用Western Blotting进行检测,验证其原核表达的正确性;2.4表达正确的蛋白,加入DYRK1A重组蛋白及缓冲体系在适当条件下进行体外磷酸化反应。体外反应后的蛋白进行蛋白电泳,对电泳后的凝胶进行考马斯亮蓝染色,脱色后将清晰的条带进行切割,切割的条带送质谱分析;2.5送检样品进行质谱检测并分析检测结果,寻找被DYRK1A磷酸化修饰的位点。3.DYRK1A对MEF2D蛋白转录活性的影响。3.1将MEF2D特异性识别位点的多拷贝序列(MRE)插入pGL3-Basic载体中,构建p3×MRE载体;3.2 应用 LipofectamineTM2000 将 DYRK1A 表达载体、DYRK1A 激酶失活载体DYRK1A(K188R)及空白对照分别与pGL3-Basic和p3×MRE载体转染入HEK293细胞中;3.3 转染48小时后收集样品进行Luciferase Assay检测,并分析检测结果。4.MEF2D磷酸化对其蛋白降解的影响。4.1分别应用LipofectamineTM2000将DYRK1A表达载体及对应空白对照与MEF2D表达载体共转染入HEK293细胞中,转染4-6小时后,分别将两组细胞均分至三个35 mm的细胞培养皿中;4.2于转染后分别向细胞中加入NH4C1,使其终浓度分别为10 mM及20 mM,H20用作空白对照,加药处理24小时;4.3加药后24小时收取细胞并裂解,蛋白定量后进行Western Blot检测,并分析检测结果。5.统计分析:应用SPSS 17.0软件处理数据,分别应用t检验以及Sperman相关分析对结果做差异性分析,P<0.05代表所得的差异具有统计学意义。研究结果1.DYRK1A过量表达可以显著升高外源MEF2D的表达水平,并使蛋白分子量发生改变,提示存在化学修饰。2.纯化MEF2D重组蛋白后进行体外磷酸化反应结合质谱分析结果显示,与空白对照相比,被DYRK1A处理过的MEF2D蛋白样品,位于251位的丝氨酸存在磷酸化修饰。3.Luciferase Assay结果显示,与pGL3-Basic相比,MEF2D可以显著性升高p3×MRE载体的活性,但DYRK1A会使p3×MRE的活性降低,而失去激酶活性的DYRK1A不会使p3×MRE的活性降低。4.被DYRK1A磷酸化的MEF2D,在NH4Cl的作用下,降解速率显著降低。结论1.DYRK1A升高MEF2D的表达水平,并对MEF2D进行化学修饰。2.质谱检测结果提示DYRK1A可以使MEF2D被磷酸化,位点为251位丝氨酸。3.DYRK1A对MEF2D的磷酸化修饰使MEF2D的转录活性降低。4.DYRK1A对MEF2D的磷酸化修饰降低了 MEF2D的降解速率。