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细胞自噬(Autophagy)是普遍存在于生物体的一种细胞自我吞噬行为,是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡(自噬小体)包裹后,送入溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物)中进行降解并得以循环利用。细胞自噬小体的形成有许多细胞自噬蛋白(Autophagy-related gene, ATG)参与并最终与溶酶体或液泡融合完成目标蛋白的降解。昆虫变态发育过程中涉及到多次蜕皮过程中新老组织交替过程,在此过程中细胞自噬发挥了重要作用,家蚕(Bombyx mori)是一种研究变态发育的经典模式昆虫,它的变态发育受到营养和蜕皮激素(Ecdysteroids)等信号的协同调控,而这些信号都能参与调控细胞自噬的过程。ATG3蛋白是自噬发生过程中的一种类泛素化E2蛋白,它催化ATG8蛋白磷脂酰乙醇胺化(Phosphatidylethanolamine, PE)的分子机制在酵母(Saccharomyces cerevisiae)中已经研究的比较清晰,但在高等动物细胞自噬中,ATG3/ATG8参与调控细胞自噬的机制尚待研究。20E是昆虫诱导自噬的重要因素,因此本文首先以摄食期和变态期家蚕血淋巴中20E滴度为参考,检测了家蚕脂肪体ATG3和ATG8蛋白的时空表达模式,通过RNA干扰技术、CRISPR/Cas9基因敲除技术和杆状病毒超表达技术进一步研究家蚕ATG3和ATG8蛋白的自噬功能；继而结合细胞转染的体外实验探究ATG3和ATG8蛋白的相互作用,最后验证20E对ATG8蛋白的调控作用。具体研究内容和研究结果如下：1.家蚕血淋巴蜕皮甾醇激素滴度测定昆虫血淋巴中有两种主要的蜕皮甾醇激素：蜕皮酮(Ecdysone)和20羟基蜕皮酮(20E),其中蜕皮酮是20E的前体,而20E是有活性的蜕皮甾醇激素,即通常所说的蜕皮激素。20E是目前公认的自噬诱导剂,测定野生型家蚕血淋巴20E滴度可作为本研究后续自噬实验的参考,研究采用高效液相色谱法(HPLC)分离摄食期和变态时期家蚕血淋巴中的两类蜕皮甾醇激素,通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定各自的滴度发现,摄食期家蚕血淋巴中的蜕皮酮和20E滴度都显著低于变态期,且变态期具有更高比例的20E。2.家蚕ATG3和ATG8蛋白抗体验证及其在脂肪体的时空表达模式研究利用Western blotting方法分析ATG3和ATG8蛋白在家蚕幼虫脂肪体内的时空表达模式。结果显示,家蚕ATG3蛋白在自噬发生时蛋白水平下降,但mRNA水平上升,暗示其蛋白在细胞自噬过程中可能有大量消耗,但会及时通过上调mRNA转录水平及时进行补充；而家蚕ATG8蛋白与其他物种不同,在营养充足的摄食时期,其仍然有低水平的ATG8-PE蛋白复合体的存在,表明ATG8-PE复合物对维持家蚕正常生长发育有一定作用。免疫组化结果显示ATG8蛋白在自噬发生时形成ATG8-PE蛋白聚集小点。3.家蚕ATG3和ATG8蛋白自噬功能研究通过RNA干扰4tg3和Atg8基因、CRISPR/Cas9技术敲除Atg3和Atg8基因以及杆状病毒超表达Atg3和Atg8基因,发现Atg3和Atg8基因被干扰或敲除后,家蚕细胞自噬水平降低,超表达Atg3和Atg8基因后细胞自噬水平升高,说明ATG3和ATG8蛋白是家蚕细胞自噬必需的；同时,Atg3基因敲除引起家蚕提前进入游走期。4.家蚕ATG3与ATG8蛋白相互作用研究敲除Atg3基因引起ATG8-PE水平降低且自噬下调,表明ATG8-PE化系统依赖于ATG3的催化。继而在BmN细胞中转染质粒,超表达mCherry-ATG3和EGFP-Atg8,经20E或饥饿诱导后,ATG3和ATG8蛋白都能聚集形成小点。但这些ATG3和ATG8蛋白小点不是以类似于酵母的细胞共定位的形式存在,而是互补的亚细胞定位关系。5.20E对家蚕ATG8蛋白的调控在其他物种中,20E可调控ATG8蛋白的活性,故而在研究家蚕ATG8及ATG3自噬功能及相互作用后,验证20E对家蚕ATG8蛋白的调控作用。活体注射20E到家蚕血淋巴中,经24小时后,ATG8免疫组化结果表明,20E可上调ATG8-PE化水平,继而上调自噬水平。家蚕ATG3和ATG8蛋白是细胞自噬必需蛋白,ATG8-PE化系统依赖于ATG3催化,且20E可调控ATG8-PE化水平。