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深入研究卵巢衰老机理对于建立及时有效的干预手段,治疗卵巢衰老相关疾病并延长女性生殖寿命具有重大意义。卵泡的数量与质量决定了卵巢的功能与寿命。其中,颗粒细胞(Granulosa cells,GCs)的活性对于卵巢形态和功能维持至关重要,而雌性生殖干细胞(Female germ stem cells,FGSCs)则是新近发现维持卵巢结构和功能的潜在途径。既往他人和我们的研究表明,可感知与响应机械信号从而控制组织器官大小、生长发育与再生的Hippo信号通路无论在调控卵巢GCs还是FGSCs增殖中均发挥重要作用,并可能影响卵巢衰老。然而其具体调控机制尚未阐明,有关GCs与FGSCs之间是否存在某种“对话”亦不清楚。故本研究拟以作为转录或转录后调控分子在卵巢功能调控及相关疾病发生中可能发挥重要作用的lncRNAs为切入点,筛选、验证并鉴定衰老卵巢中与Hippo信号通路密切相关的lncRNAs,并观察、分析Hippo-TEAD2密切相关的lncRNA在GCs和FGSCs中的功能及作用机制。本研究首次揭示了与卵巢衰老密切相关的长链非编码RNA-lnc81,并证实lnc81可能通过Hippo-TEAD2-CCN1/2信号通路调控GCs和FGSCs的增殖凋亡,为深入探讨维持雌性卵巢生理功能的内在机制增添新资料,为治疗和延缓卵巢衰老提供了重要的理论依据。第一部分卵巢衰老相关且靶向Hippo-TEAD2的lncRNAs的筛选、鉴定与表达研究为研究卵巢衰老相关lncRNAs在调控卵巢功能中的作用,我们利用生物信息学分析技术,筛选与卵巢衰老相关并靶向Hippo-TEAD2相关的lncRNAs。通过PCR、Western blot、RIP和RACE等实验技术,鉴定了lnc81的真实存在,验证了其与TEAD2的结合情况。观察lnc81在生理性卵巢衰老过程中的表达变化及其在卵巢颗粒细胞和雌性生殖干细胞中的亚定位情况,同时检测TEAD2靶基因CCN1、CCN2在不同鼠龄卵巢中的相对表达量变化。结果显示:(1)lnc81是一条与卵巢衰老密切相关的长链非编码RNA,全长1877 bp,位于4号染色体上(为chr4:3229208-3255028);(2)lnc81高表达于小鼠卵巢组织中,随着小鼠月龄的增长,lnc81表达水平显著增加(p<0.05);(3)lnc81在卵巢颗粒细胞和雌性生殖干细胞中均有表达,且主要定位于细胞核中;(4)lnc81可靶向结合Hippo信号通路主要组分TEAD2蛋白;(5)CCN1 mRNA和蛋白表达随着小鼠月龄的增长均显著减少(p<0.05,与3 d组相比);而CCN2 mRNA和蛋白在3 m组中均显著增加(p<0.05,与3 d组相比),随后在11 m和17 m组中显著减少(p<0.05,与3 d组相比)。这些结果提示长链非编码RNA lnc81与卵巢生理性衰老相关,且与Hippo效应分子TEAD2以及相应靶基因CCN1、CCN2可能存在某种相关关系。第二部分lnc81在卵巢颗粒细胞中的生物学作用及机制研究为阐明lnc81在卵巢GCs中的生物学作用,我们利用siRNA转染降低GCs中lnc81的表达水平,观察GCs的增殖、凋亡水平变化,分析Hippo信号通路下游分子TEAD2、CCN1、CCN2的表达变化。此外,还进一步深入研究了CCN1和CCN2在人颗粒细胞功能调控中的作用和机制。结果发现:(1)lnc81表达水平下调可抑制GCs增殖;(2)lnc81表达水平下调可促进GCs凋亡;(3)lnc81表达水平下调后,TEAD2、CCN1、CCN2的mRNA和蛋白表达量均增加(p<0.05);(4)YAP介导了1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)诱导的GCs中CCN1、CCN2、COX2表达上调。这些结果表明Hippo信号通路在卵巢颗粒细胞功能调控中具有重要作用,lnc81可通过Hippo信号通路调控颗粒细胞功能。第三部分lnc81在雌性生殖干细胞以及颗粒细胞调控雌性生殖干细胞中的生物学作用及功能初探为观察lnc81在雌性生殖干细胞中(FGSCs)的生理功能,我们下调lnc81在FGSCs中的表达后利用CCK检测分析、EDU染色、Tunel染色等实验手段,观察了lnc81对FGSCs增殖、凋亡水平的影响。此外,将FGSCs与GCs共培养后观察FGSCs的增殖变化,并利用PCR和Western blot技术探究lnc81及Hippo信号通路在GCs调控FGSCs增殖过程中的可能作用机制。结果显示:(1)lnc81表达水平下调可抑制FGSCs增殖;(2)lnc81表达水平下调可促进FGSCs凋亡;(3)lnc81表达水平下调后,TEAD2、CCN1、CCN2的mRNA和蛋白表达量均增加(p<0.05);MVH mRNA和蛋白表达水平显著降低(p<0.05),而OCT4 mRNA和蛋白表达水平不变;(4)与FGSCs单独培养相比,FGSCs与GCs共培养后其增殖水平显著降低(p<0.05),且GCs密度越高FGSCs增殖水平越低(p<0.05);与GCs共培养后,FGSCs中lnc81表达量降低,且共培养时GCs的数量越多,lnc81下降水平越明显;与GCs共培养前后,FGSCs中CCN1 mRNA和蛋白表达水平不变;与对照组相比,高密度组和低密度组中CCN2 mRNA和蛋白表达水平降低(p<0.05);与对照组和低密度组相比,高密度组中PCNA mRNA水平降低(p<0.05),BAX/BCL-2 mRNA和蛋白水平增加(p<0.05)。这些结果进一步证明lnc81对FGSCs的增殖调控作用,表明lnc81和CCN2可能介导了GCs对FGSCs的增殖调控,也提示lnc81在卵巢微环境中细胞间的相互作用中发挥作用。