他汀类药物对胰岛β细胞功能的影响和作用机制探讨以及新型HMG-CoA还原酶抑制剂的发现　　 糖尿病并发症是严重威胁2型糖尿病患者生命的危险因素之一，且2型糖尿病患者常伴有高胆固醇血症。而心血管壁内胆固醇等脂质的沉着和堆积，导致2型糖尿病患者冠心病、心肌梗塞等心血管病的发生率显著增加。因此，调节脂质代谢紊乱是治疗2型糖尿病的重要方案之一。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA reductase)是体内胆固醇合成的限速酶，他汀类药物属于HMG-CoA还原酶抑制剂，可以与底物结合并竞争性地抑制该酶活性，从而减少胆固醇的合成。目前，他汀类已成为糖尿病心血管并发症一、二级预防的关键治疗药物。2001年报道的WOSCOPS临床试验显示，普伐他汀可使糖尿病的发生率较安慰剂组降低30％，研究者推测这可能与其能够显著降低血甘油三酯有关。目前，应用于临床的他汀类药物主要包括天然化合物和全合成化合物，天然化合物包括洛伐他丁、辛伐他汀和普伐他汀等，全合成化合物包括氟伐他汀、阿托伐他汀、匹伐他汀和瑞舒伐他汀等。其中，普伐他汀和瑞舒伐他汀为水溶性，其它5个品种属于脂溶性。据报道，他汀类的溶解性能够影响其代谢途径和药理活性。因此，本文选择了阿托伐他汀(Ator)和普伐他汀(Prav)两种不同溶解性的他汀类药物作为研究对象。近年来，许多研究也发现他汀类药物降脂作用外的多种药理效应，包括对机体胰岛素抵抗和葡萄糖代谢的改善，但对胰岛β细胞功能是否有直接的改善作用尚未见报道。因此，本论文旨在：1）探讨他汀类药物对胰岛β细胞的作用及其机制；2）建立月旨毒性诱导的胰岛β细胞凋亡模型，并考察他汀类药物的对β细胞凋亡的保护作用；3)建立并优化体外HMG-CoA还原酶抑制剂的筛选方法，对一定量的化合物进行活性评价，为寻找和发现新结构的HMG-CoA还原酶抑制剂奠定实验基础和提供技术平台。　　 (1)他汀类药物对2型糖尿病实验动物模型胰岛β细胞功能的影响及其机制研究：　　 采用高脂诱导的肥胖C57BL/6J小鼠和自发性2型糖尿病KKAy小鼠两种模型动物，以二甲双胍作为阳性对照药，考察阿托伐他汀（Ator，剂量30mg/kg）和普伐他汀（Prav，剂量30mg/kg）对上述2种模型动物的糖、脂代谢紊乱及胰岛β细胞功能的改善作用。　　 在C57BL/6J小鼠模型中，Ator和Prav可显著降低模型动物体重，其中Ator能够在一定程度上改善C57BL/6J小鼠的胰岛素敏感性。在高血糖钳夹实验中，Ator和Prav都可显著增加稳态葡萄糖输注速率(GIR)，提示Ator和Prav能够显著改善胰岛β细胞的胰岛素分泌功能。基因水平表达变化结果显示，Ator和Prav可显著上调C57BL/6J小鼠胰腺中PDX-1和LXR-β的基因表达水平，可能对胰岛β细胞中的胰岛素合成及脂质代谢环节具有一定的改善作用。Western blot结果显示，Ator和Prav均能够显著降低内质网应激相关蛋白ATF4和Chop的表达，且增加胰腺增殖相关的PDX-1蛋白表达，其中Ator还能够降低内质网应激途径中磷酸化eIF2α蛋白的表达。　　 在KKAy小鼠模型中，两种他汀类药物均能显著降低模型动物的血甘油三酯、胆固醇和血胰岛素水平。其中，Ator能够显著改善KKAy小鼠的葡萄糖耐量异常，Prav能够显著降低KKAy小鼠胰岛素耐量实验中的40 min血糖及AUC，改善其胰岛素敏感性，Prav还可显著降低血浆中过氧脂质化物——丙二醛(MDA)的含量。表明Ator和Prav具有显著调节KKAy小鼠糖、脂代谢紊乱，改善胰岛素敏感性及氧化应激状态等作用，采用实时定量PCR技术考察两种药物对胰腺组织中脂质及能量代谢相关基因变化的影响。结果显示：Ator可显著上调胰腺组织中AMPK、Bc1-2、LXR-β等基因的表达，并且Ator和Prav均能显著上调SREBP-2的表达，提示两种他汀类药物可能通过调节胰腺中能量及脂质代谢相关基因，降低模型动物的胰腺脂毒性，并通过上调抗凋亡基因的表达，对胰岛细胞凋亡具有一定保护作用。Western blot结果显示，两种他汀类药物均能显著降低内质网应激的关键蛋白Chop的表达，提示两种他汀类药物可能通过降低内质网应激，缓解胰岛β细胞内的代谢压力，从而对糖、脂代谢压力导致的胰岛素分泌功能紊乱及细胞凋亡具有一定的缓解和保护作用。　　 以上结果提示，Ator对胰岛β细胞功能的改善作用可能是通过作用于eIF2α-ATF4-Chop通路而缓解了细胞内质网应激；Prav对胰腺β细胞功能的影响也可能是通过影响该通路中的部分因子而实现的。　　 (2)胆固醇诱导的胰岛β细胞凋亡模型的建立以及阿托伐他汀对β细胞凋亡的保护作用　　 胆固醇在胰岛β细胞膜上的沉着和堆积将导致其分泌功能的紊乱及内质网应激。本部分的研究以小鼠胰岛细胞瘤细胞株NIT-1细胞为研究对象，模拟体内高胆固醇环境，建立胰岛β细胞的凋亡模型。结果显示，用终浓度为0.125 mM的水溶性胆固醇与NIT-1细胞共同孵育18h后，细胞的活力显著降低并发生凋亡，形成适宜于试验的细胞凋亡模型。Ator可剂量依赖性地增加高胆固醇脂毒性诱导NIT-1细胞损伤后的细胞活力，并且流式细胞检测结果显示，Ator在10-8M浓度下可以显著降低细胞的凋亡发生率。Western blot结果显示，Ator干预能够明显降低凋亡模型NIT-1细胞中内质网应激蛋白磷酸化eIF2α水平，提示Ator可显著改善高胆固醇诱导的胰岛β细胞内质网应激。　　 (3) HMG-CoA还原酶抑制剂筛选方法的优化和活性化合物的筛选　　 根据体内胆固醇合成的限速反应方程式：(S)-HMG-CoA+2NADPH+2H→(R)-甲羟戊+CoA+2NADP+，HMG-CoA还原酶可以利用NADPH所携带的2个H原子将底物S)-HMG-CoA还原为(R)-甲羟戊酸。本研究在已有筛选方法的基础上，对实验步骤和所用试剂进行了优化，使反应体系更加完善，结果重现性较好。Ator作为阳性对照药的适宜筛选浓度为10-7M。对150多个化合物进行了筛选，发现其中有数个化合物对HMG-CoA还原酶有抑制作用，且IC50为10-5-10-6 M，但与Ator相比，活性仍存在较大差距。因此仍期待发现活性更强的先导化合物。