论文部分内容阅读
背景:吴茱萸碱（Evodiamine,EVO）是干的吴茱萸果实中提取的一种重要的天然小分子化合物,作为一种天然的吲哚生物碱,具有多种生物学活性,其中其抗肿瘤,抗炎,镇痛及胃粘膜保护作用的研究已经相对比较成熟,同时,吴茱萸碱在调节胃肠动力及内脏敏感性方面也表现出了潜在的价值,目前研究较少,且机制尚不明确。胃肠动力受多种因素共同调节,其中中枢神经系统,肠神经系统,Cajal细胞及平滑肌发挥着主要作用,也是调节胃肠动力药物作用的主要靶点。在众多参与平滑肌舒缩活动的离子通道中L-型钙通道及大电导钙激活钾通道扮演着十分重要的角色,二者均在肠道平滑肌及黏膜下广泛表达,参与肠道平滑肌收缩及细胞兴奋性的调节;众多研究表明,NO在胃肠道中可作为抑制性气体分子参与调节胃肠运动,且在心血管系统研究中发现EVO与NO的产生高度相关。另有研究报道,吴茱萸碱与部分胃肠激素如CCK及脑源性神经营养因子如BDNF的产生和释放密切相关,同时可以作为辣椒素受体（TRPV1）的高选择性配体参与疼痛的调节。肠易激综合征（irritable bowel syndrome,IBS）是一种较为常见的功能性胃肠病,主要以腹痛,腹胀,腹部不适,大便习惯改变为特征,临床缺乏特异性症状和体征,也无特异性生化改变,病因和发病机制尚不明确,目前一致认为肠道动力异常及内脏感觉异常与该病的发生发展息息相关。本研究主要探讨吴茱萸碱在调节胃肠动力及内脏敏感性方面的作用及相关机制,为临床新药的研发提供相应的理论依据,为功能性胃病的临床治疗提供新的思路。目前吴茱萸碱已被推荐用于腹痛、胃酸不全、恶心、腹泻等胃肠功能紊乱相关疾病。第一部分吴茱萸碱在调节慢性应激大鼠胃肠动力中的作用及其机制探讨目的:探讨吴茱萸碱对慢性应激大鼠胃肠动力的影响及相关分子学机制方法:采用慢性避水应激法构建大鼠模型,计算24h粪粒数及墨汁灌胃后首粒黑便排出时间以判断EVO对大鼠胃肠推进运动的影响;以结肠为代表,制备离体平滑肌肌条,采用RM6240多通道生理信号采集系统检测EVO及胆囊收缩素（CCK）对大鼠近端结肠平滑肌自发收缩活动的影响;采用ELISA法检测大鼠血清中胃肠激素CCK的水平,采用Western blot检测大鼠结肠组织NO合成酶的表达水平。结果:慢性避水应激显著促进大鼠胃肠运动,慢性避水应激组大鼠纵行肌（LM）和环形肌（CM）的收缩幅度较假性避水应激组均明显增加（LM:（1.22±0.08）g vs（0.69±0.03）g,P＜0.05;CM:（0.80±0.06）g vs（0.52±0.04）g,P＜0.05）;EVO可剂量依赖性的抑制大鼠结肠平滑肌的收缩,且该作用不被TTX及CCK1R所阻断,在0,10,20,40μM的EVO孵育下纵行肌收缩幅度分别为:（1.11±0.12）g,（0.77±0.06）g,（0.45±0.07）g,（0.28±0.06）g,（P＜0.05,n=5）;在0,5,10,20μM EVO孵育下环形肌的收缩幅度分别为（0.74±0.09）g,（0.55±0.03）g,（0.26±0.02）g,（0.13±0.007）g,其中10μM,20μM EVO作用下,其收缩幅度较加药前差异有统计学意义,（P＜0.05,n=5）;EVO可延长慢性避水应激大鼠的胃肠传输时间,剂量依赖性的升高慢性应激大鼠血清中CCK-8的水平;外源性CCK-8（5μM）可明显抑制大鼠结肠肌条的收缩,加药前纵行肌和环形肌的收缩幅度分别为（1.21±0.13）g,（0.66±0.11）g,加入CCK-8（5μM）孵育10分钟后,纵环形肌的收缩幅度分别降至（0.67±0.15）g,（0.41±0.08）g,加药前后差异有统计学意义（P＜0.05,n=5）,且上述作用可以被CCK1受体阻断剂完全阻断;外源性CCK-8可以延长大鼠胃肠传输时间,但CCK-8受体阻断剂不能完全逆转EVO诱导的胃肠传输时间延长;EVO促进大鼠结肠NO的产生,且主要表现为EVO给药组n NOS蛋白表达较DMSO组显著增高;差异有统计学意义（P＜0.05）,而WAS组较SWAS组n NOS的蛋白水平无明显差异（P＞0.05）结论:慢性避水应激显著促进大鼠胃肠推进运及结肠自发收缩活动,EVO可以可有效抑制大鼠胃肠传输及结肠自发收缩活动,且上述作用可能是通过促进大鼠血清CCK-8的表达及结肠组织神经型NO的产生来实现的。第二部分吴茱萸碱对大鼠结肠平滑肌细胞L-型钙通道及大电导钙激活钾通道的影响目的:探讨吴茱萸碱对大鼠平滑肌细胞L-型钙通道及大电导钙激活钾通道的影响方法:选取健康SD大鼠,取近端结肠组织,在组织显微镜下剥离黏膜层及黏膜下层组织,制备无黏膜层离体平滑肌肌条,采用RM6240多通道生理信号采集系统检测EVO对大鼠近端结肠平滑肌收缩活动的影响,采用Ⅱ型胶原酶+胰蛋白酶抑制剂消化分离结肠平滑肌细胞,选取活性良好的平滑肌细胞,采用全细胞膜片钳技术,在电压钳模式下检测吴茱萸碱对L-型钙通道电流大小及稳态激活失活的影响,同样的方法检测吴茱萸碱对大电导钙激活的钾通道电流的影响。结果:去掉黏膜层和黏膜下层后,EVO对大鼠结肠肌条自发收缩活动的抑制作用依然存在。20μM的EVO孵育前,环形肌的平均收缩幅度为（0.47±0.02）g,孵育后平均收缩幅度降为（0.29±0.05）g,加药前后差异有明显的统计学意义（P＜0.05,n=5）;加药前,纵行肌的平均收缩幅度为（0.82±0.12）g,EVO（40μM）孵育后,其收缩幅度降为（0.49±0.14）g,加药前后差异有统计学意义（P＜0.05,n=5）。上述抑制作用均不能被TTX（1μM）所阻断。在电压钳模式下,全细胞膜片钳技术检测EVO对L-型钙通道电流的影响,结果提示:峰电流均出现在0m V处,加入EVO孵育前,平均峰电流密度为（-5.17±0.35）p A/p F,加入不同浓度的EVO（5μM,10μM,20μM）孵育后峰电流密度分别降为（-3.10±0.16）p A/p F,（-2.98±0.26）p A/p F,（-1.39±0.22）p A/p F。予以同等剂量的DMSO（1,2,4μl）孵育后,电流曲线及峰电流密度均未见明显改变。加入不同浓度EVO孵育2min后,电流开始趋于稳定,洗脱后,电流可部分恢复,证明EVO对L-型钙通道电流的抑制作用是不完全可逆的。从I-V曲线可见,任何测试脉冲刺激下EVO对L-型钙通道电流均有抑制作用,但是EVO并不改变I-V曲线的形状,同等剂量的DMSO孵育后,同样不改变I-V曲线的形状。EVO对L-型钙通道的稳态激活无明显影响,EVO孵育前后V1/2分别为（-18.78±2.42）m V,（-19.73±2.30）m V,差异无明显统计学意义（P＞0.05,n=5）,斜率因子分别为3.94±2.53,3.78±2.71,差异同样无统计学意义（P＞0.05,n=5）。EVO对L-型钙通道的稳态失活也无明显影响,EVO（10μM）孵育前后V1/2分别为（-30.96±0.48）m V vs（-32.24±0.48）m V,差异无明显统计学意义（P＞0.05,n=5）。斜率因子κ分别为5.56±0.43 vs 5.19±0.41,差异无明显统计学意义（P＞0.05,n=5）。不同浓度的EVO（5μM,10μM）均可抑制各测试脉冲下钾电流的大小,且有一定的剂量依赖性,但不改变I-V曲线的形状,其中峰电流均出现在+60m V处。EVO孵育前平均峰电流密度为（17.93±1.49）p A/p F,EVO（5μM,10μM）孵育后平均峰电流的密度分别为（12.13±1.23）p A/p F,（5.73±1.56）p A/p F,差异有统计学意义（P＜0.05,n=5）结论:吴茱萸碱对结肠自发收缩活动的抑制作用不完全是黏膜依赖的,吴茱萸碱可剂量依赖性的抑制大鼠结肠平滑肌细胞L-型钙通道电流的大小,但不改变其I-V曲线的形状,对L-型钙通道的稳态激活和稳态失活均无影响;EVO可剂量依赖性的抑制BKCa通道电流的大小,但不改变其I-V曲线的形状。第三部分吴茱萸碱对慢性应激大鼠内脏敏感性的影响及机制探讨目的:探讨吴茱萸碱对慢性应激大鼠内脏敏感性的影响及可能的机制方法:选取健康SD大鼠,采用慢性避水应激法构建大鼠模型,采用Powerlab检测结肠扩张刺激下大鼠腹外斜肌电活动,以曲线下面积（AUC）表示腹外斜肌收缩强度,采用免疫组化法检测大鼠结肠SP的水平,采用Western blot检测大鼠结肠组织TRPV1,p-TRPV1,CGRP的蛋白水平。结果:慢性应激大鼠对结肠扩张刺激的反应性较假性避水应激组明显增高,腹壁肌电检测结果显示:给予1ml生理盐水扩张刺激时,慢性应激组大鼠和假性避水应激组大鼠腹外斜肌收缩强度分别为:360.47±60.78μV*s,162.08±27.95μV*s,差异有统计学意义（p=0.018,n=10）;在0ml,0.6ml,1.4ml生理盐水扩张刺激下,两组的反应性均无明显差异。给予慢性应激大鼠不同剂量（0.67,2.0,6.0mg/kg）的EVO治疗后,腹外斜肌肌电检测结果提示:0.6ml生理盐水扩张刺激时WAS,DMSO,EVO（L）,EVO（M）及EVO（H）组的AUC平均值分别为:（124.31±6.90）μV*s,（157.58±28.05）μV*s,（216.01±18.44）μV*s,（186.05±32.78）μV*s,（121.64±29.09）μV*s,各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。1.0ml生理盐水扩张刺激时上述各组的AUC平均值分别为:（366.00±49.93）μV*s,（306.27±18.19）μV*s,（294.44±22.36）μV*s,（215.59±31.24）μV*s,（193.07±30.29）μV*s,其中EVO（H）组较WAS组,DMSO组比较差异有统计学意义（P＜0.05）,EVO（M）,EVO（L）组较DMSO组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。给予1.4ml生理盐水扩张刺激时,上述各组的平均AUC值分别为:（469.30±24.09）μV*s,（365.53±31.81）μV*s,（433.80±29.08）μV*s,（434.14±68.92）μV*s,（351.60±27.23）μV*s,各组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。结肠肌条对Ach刺激的反应性检测发现,EVO（H）组的纵行肌条对Ach刺激的反应性较DMSO组显著降低,但对环形肌却无上述作用。其他各组与对照组相比差异均无统计学意义。蛋白水平检测结果提示:WAS组大鼠结肠TRPV1的水平较SWAS组显著升高（P＜0.05）,但p-TRPV1的水平较DMSO组未见明显差异,EVO（M,）EVO（H）给药组大鼠结肠组织TRPV1,p-TRPV1的水平较DMSO组显著降低,差异有统计学意义（P＜0.05）,SP及CGRP的表达各组间无明显差异（P＞0.05）。结论:慢性应激大鼠内脏敏感性增加,EVO可有效降低慢性应激大鼠的内脏敏感性,且该作用与结肠SP,CGRP的水平无关,可能是通过钝化TRPV1受体导致p-TRPV1降解来实现的,但不排除EVO可直接下调结肠组织TRPV1表达的可能。