研究背景听力损失（Hearing Loss,HL）是人类最常见的感觉障碍之一,世界上超过5%的人口（约4.66亿人）患有听力残疾,在中国,每年大约有3万名先天性听力损失婴儿出生,这个庞大的群体给社会造成了巨大的经济负担。大约60%的先天性听力残疾儿童是由遗传因素导致,遗传性耳聋具有高度遗传异质性。现阶段耳聋基因检测方法诊断率可达33.5%～56.67%,但还有相当一部分患者未能得到及时有效诊断。有学者提出全外显子组测序（Whole Exome Sequencing,WES）一步式分子诊断策略,但有些基因并不能包含在WES内,如GJB2基因非编码外显子、STRC基因,而且对于患者家庭而言还存在一定的经济负担。现阶段已有多个研究提出逐步进行分子诊断的梯级检测思路,并证明了梯级检测策略在遗传性耳聋分子诊断上的优势。研究目的本研究提出一种多重PCR检测、一代测序、多重连接依赖探针扩增技术（Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification,MLPA）和全外显子组测序的耳聋基因梯级检测策略,旨在探究梯级检测方案在听力损失家系分子诊断上的应用。研究方法1.这项研究共纳入152个听力损失家系,首先,利用课题组自主研发的多重PCR高通量测序试剂盒对152个家系所有成员检测常见耳聋基因GJB2、SLC26A4和MT-RNR1的编码区。2.对多重PCR未诊断的携带GJB2单杂合突变的四个家系进行GJB2非编码外显子的一代测序。3.在上述步骤未确诊的先证者中,我们筛选出所有轻度至中度的听力损失先证者进行STRC基因的MLPA检测。4.上述步骤未诊断先证者全部纳入全外显子组测序,以确定他们的潜在遗传病因。另外,步骤1中检测出的GJB2:c.109G＞A纯合子或与其他GJB2变异形成复合杂合子的先证者也纳入全外显子组测序,以探索其他潜在分子病因。5.为确认全外显子组测序检测到的候选变异,并对家系成员进行共分离分析,我们对家系成员进行候选变异一代测序验证,并且根据ACMG指南对检测到的变异进行变异解读。研究结果1.多重PCR检测共诊断了80个家系,贡献的诊断率为52.6%（80/152）,其中GJB2占29.6%（45/152）,SLC26A4占21.7%（33/152）,MT-RNR1占1.3%（2/152）。检出GJB2基因最常见热点突变为c.235del C,SLC26A4基因最常见热点突变是c.919-2A＞G,致病基因为MT-RNR1的两名先证者均携带m.1555A＞G同质突变。多重PCR还检出四名先证者携带GJB2单杂合突变。2.四个携带GJB2单杂合突变的家系进一步进行GJB2非编码外显子的一代测序,其中一家先证者（3312201）检出c.-23+1G＞A变异,与c.235del C形成复合杂合突变,该家系得到诊断。3.四名轻中度听力损失的先证者通过MLPA分析,检测到其中两名先证者携带STRC基因的纯合缺失,得到诊断。4.经上述步骤未确诊的69名先证者进行全外显子组测序,检测结果为17个家系诊断和11个家系可能诊断,WES最高额外贡献诊断率为18.4%（28/152）。WES检出15种致病基因的46种变异,其中21种（45.7%）为新变异。WES结合深度临床表型分析鉴定出11例先证者为综合征型耳聋。在本队列中,WES鉴定出国内首个由MPZL2基因变异导致轻中度听力损失的家系。两名携带GJB2:c.109G＞A和c.235del C复合杂合突变的先证者经WES检测未发现与耳聋相关的其他基因变异。5.本研究队列152个听力损失家系的总体诊断率为65.8%（100/152）～73%（111/152）。研究结论本研究提高了听力损失家系队列的诊断率;证明了梯级检测策略在听力损失分子诊断中的优势;揭示了丰富的表型差异,突出了WES结合深度临床表型分析在诊断综合征型耳聋（Syndromic Hearing Loss,SHL）方面的优势;扩大了多个耳聋基因变异谱。