论文部分内容阅读
研究目的：通过将PHY106-CHBV质粒(含C基因型HBV的全基因组)转染至体外培养的正常人肾小球系膜细胞(NHMC),研究乙型肝炎病毒(HBV)在NHMC细胞内的表达和对细胞凋亡的影响及淋巴细胞对表达乙肝标志物的NHMC细胞凋亡的影响。初步探讨乙型肝炎病毒在乙型肝炎病毒相关性肾炎(HBV-GN)肾损伤中的作用机制。方法：采用脂质体转染法将C基因型重组全长乙型肝炎病毒(PHY106-CHBV)转染至人肾小球系膜细胞(NHMC)。收集24、48和72h细胞培养上清液,进行HBsAg与HBeAg的定量检测；应用倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞形态学变化。MTT法检测NHMC细胞增殖率。流式细胞仪检测NHMC细胞凋亡率。半定量RT-PCR检测Bax、Bcl-2mRNA在NHMC细胞内的表达情况。Caspase-3酶活性检测试剂盒检测NHMC细胞内Caspase-3酶的活性。将人外周血淋巴细胞与各组NHMC细胞共培养,收集48h培养上清液进行HBsAg与HBeAg的定性检测。MTT法检测与人外周血淋巴细胞共培养的NHMC细胞的增殖率。流式细胞仪检测共培养NHMC细胞的凋亡率。结果：转染PHY106-CHBV的NHMC细胞培养上清液中可检测至(?)HBsAg和HBeAg的高表达。转染PHY106-CHBV48h后可诱导人肾小球系膜细胞形态学发生变化,表现为细胞皱缩、聚集,细胞稀疏,呈放射状,细胞核出现大小不等的凋亡小体。MTT结果显示实验组细胞增殖受抑；流式细胞仪检测显示实验组细胞凋亡率(5.84±1.70)%与正常对照组(1.09±0.55)%及阴性对照组(1.58±0.67)%比较明显增加(P<0.01)；半定量RT-PCR检测结果示实验组中Bax mRNA的表达比值为(0.32±0.02),高于空白对照组(0.22±0.02)及阴性对照组(0.25±0.02),其差异有统计学意义(P<0.01)；Bcl-2mRNA的表达比值在实验组为(0.77±0.03)、空白对照组为(0.75±0.03)、阴性对照组为(0.75±0.01),其差异均无统计学意义(P>0.05)；Caspase-3酶活性检测显示转染PHY106-CHBV后可活化Caspase-3,其差异有统计学意义(P<0.01)。NHMC细胞与人外周血淋巴细胞共培养后,实验组细胞培养上清液中可检测至(?)HBsAg和HBeAg的高表达。MTT结果显示NHMC细胞增殖受抑制。流式细胞仪检测结果显示NHMC细胞凋亡率增加。实验组细胞凋亡率(5.35±0.67)%与正常对照组(0.93±0.17)%及阴性对照组(1.22±0.22)%比较明显增加(P<0.01)。结论：HBV可在人肾小球系膜细胞内高表达,且能抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。HBV能够增强促凋亡基因Bax表达,通过活化Caspase-3诱导人肾小球系膜细胞凋亡。人外周血淋巴细胞可导致表达乙肝标志物的NHMC细胞凋亡增加。