背景麻醉药物和镇静药物对于神经系统的损害作用一直以来都是麻醉领域的研究热点,异丙酚(propofol)是一种新型的短效静脉麻醉药物,广泛应用于临床麻醉诱导、维持及ICU镇静,具有起效快,麻醉状态可控性强,维持时间短,苏醒迅速,无积蓄,副作用小等优点。已有学者发现异丙酚可阻断人的工作记忆,并可造成健忘症的发生,但是Lee等的研究却发现单次输注异丙酚并不会引起成年和老年大鼠的记忆损害。然而在临床上异丙酚的用途不仅是单次输注,在全凭静脉麻醉时及ICU内可作为连续或间断使用达数次或数小时乃至数天之久,因此仅凭单次输注来判断异丙酚是否具有学习、记忆能力损害作用并无实际意义。目前的临床证据尚不足以证明异丙酚与学习、记忆能力损害之间存在因果关系,而临床用药的多样性必然使得观察人的神经损害与异丙酚的关系复杂化,因此在积累临床数据的同时,有必要通过进一步的动物实验来研究异丙酚和神经损害之间的关系和相应的机制。哺乳动物成年神经再生的发现颠覆了长久以来认为成年大脑不能产生新生神经元的观点。成年神经再生,起源于神经前体细胞,可在成年大脑的两个区域发生：侧脑室的脑室下区和海马齿状回区的背侧区。成年神经再生是神经干细胞的增殖、分化、成熟及向神经回路整合,产生新生神经元的过程。海马是哺乳动物边缘系统的一个重要的结构,海马的结构内部可分为齿状回、CA1区、CA3区三个主要组成部分。海马齿状回区是哺乳动物成年期新生神经元生成的几个脑区之一,是在记忆过程尤其是建立和应用空间学习记忆时发挥重要作用的神经集成网络的重要组分。迄今为止,已知的麻醉药物的作用机制主要是调控中枢神经系统关键部位的突触传递和神经细胞膜上的离子通道。异丙酚也主要作用于突触,调节突触前膜递质的释放和突触前后膜Y-氨基丁酸受体的功能,从而产生中枢抑制效应,发挥麻醉作用。但是异丙酚具体作用的分子机制还不清楚。大部分在突触传递中发挥重要作用的神经递质和离子通道都是蛋白质。蛋白质是生命活动的最主要和最直接的体现者和执行者,也是多种致病因素和药物作用的靶分子。蛋白质修饰尤其是磷酸化和去磷酸化作用,在不同的细胞功能如细胞分化、细胞生长、细胞凋亡等发挥重要作用。研究表明,阿尔茨海默病的脑组织的tau蛋白异常磷酸化作用发生在神经纤维缠结之前,而且,经过异氟醚和地氟醚吸入的动物体内tau蛋白磷酸化作用增强,这种作用可能导致麻醉后短期认知功能障碍。因此发现异丙酚输注后不同脑区磷酸化蛋白的水平的而变化对探讨异丙酚的可能的神经毒性机制是非常重要的。大脑是一种高度交互的实体,一些独立的大脑区域协作发挥生物学功能。丘脑被认为是皮质下区和大脑皮层的信息传递部位。而且,功能性脑成像也证实丘脑是麻醉药作用的主要脑区。研究显示海马主要负责心理思维过程,比如最初的学习记忆能力也包括意识行为。Wei等曾报道异丙酚可能由于其对学习记忆能力的影响,从而促进大鼠海马CA1区突触的长时程抑制的发展。大脑皮层是唤醒系统的最后的靶向脑区,同时背外侧的前额皮质是大脑皮层最重要的部分,参与许多生理过程,如情感认知,随意运动,工作记忆,甚至维持哺乳动物的激活状态。本研究第一部分通过Morris水迷宫实验和免疫荧光技术及激光共聚焦技术来观察异丙酚重复镇静对大鼠空间学习记忆能力和海马齿状回新生神经元的影响,进一步探讨异丙酚可能存在的神经毒性作用。第二部分通过从异丙酚麻醉的动物模型中分离提取丘脑、海马、额叶的磷酸化蛋白,然后用二维电泳和质谱分析法筛选及鉴定异丙酚作用于不同脑区后对磷酸化蛋白表达水平的影响,为后续研究其相应的机制奠定基础。材料与方法1.SD成年雄性大鼠分别腹腔给予异丙酚或脂肪乳,每天2次,持续7天。首先,应用Morries水迷宫实验观察和检测大鼠给药后28天的空间学习和记忆能力。其次,给药后,经腹腔注射BrdU标记,分别计数给药后1天、14天和28天大鼠海马齿状回颗粒下区BrdU阳性细胞数。最后,应用激光共聚焦显微镜扫描给药后14天大鼠新生神经元的树突长度和分枝数目。2.SD成年雄性大鼠分别尾静脉给予异丙酚或脂肪乳,20min后断头取丘脑、海马、额叶。首先提取三个脑区磷酸化蛋白后双向凝胶电泳检测差异表达的磷酸化蛋白,然后用MALDI-TOF MS鉴定并在数据库中搜索。最后Western Blot验证差异表达的磷酸化蛋白。结果1.异丙酚镇静28天后,大鼠的逃逸潜伏期、游泳距离明显延长,第5天在目标区域的停留时间明显减少。异丙酚在给药后第1天BrdU阳性细胞数无显著差异,但是第14天和第28天则显著减少。在给药后第14天大鼠海马齿状回颗粒下区异丙酚组的DCX阳性细胞数显著少于溶媒对照组,异丙酚组的DCX阳性新生神经元的树突长度和分枝数目显著低于溶媒对照组。2.双向凝胶电泳显示丘脑、海马、额叶这三个脑区共有21个蛋白位点显著不同,其中经MALDI-TOF MS成功鉴定的有16个磷酸化蛋白位点。讨论海马是中枢神经系统中参与认知功能如学习记忆能力等功能的最主要部位,海马齿状回区是生命活动中不断产生新生神经元的一个重要脑区。Deng等人综述了许多关于新生神经元对学习和记忆能力影响的报道,然而这些报道有些认为减少神经再生会损害海马依赖的学习和记忆能力,另一派则认为神经再生的减少并不发挥什么作用。以往也有报道认为空间学习能促进新生神经元增殖,增加新生神经元的存活率,亦可能减少新生神经元的数量。因此,本研究旨在进一步探讨新生神经元与空间学习记忆能力的关系,以及异丙酚作用对其的影响。这些新生神经元经过神经前体细胞的不断增殖,形成神经连接和突触,逐渐成为具有记忆能力的成熟的神经元。它们主要位于海马齿状回区,大约4周后具有空间学习的能力。我们的结果发现异丙酚作用的大鼠在给药后4周开始出现行为学损害,这也恰好是新生颗粒细胞具备参与到现有神经环路中的能力的时候。并且,我们在给药后分别计数了2组大鼠颗粒下区的BrdU阳性细胞数。在给药后1天,两组BrdU阳性细胞数的差异无统计学意义,说明异丙酚对于海马成年神经干细胞的增殖并无影响。然而在给药后28天,异丙酚重复镇静组的大鼠颗粒下区BrdU阳性细胞数则显著低于溶媒对照组,提示异丙酚可能损伤的是增殖中的细胞。这些结果表明异丙酚重复镇静可损害成年神经再生,尤其是与学习能力密切相关的神经前体细胞的存活,进而影响由神经前体细胞增殖分化而成的神经元的数量。微管相关蛋白(doublecortin,DCX)作为神经元前体细胞的标志物可以用来研究神经元前体细胞的增殖和迁移。我们选择DCX——成年海马齿状回新生神经元可靠的标志物,对其进行免疫染色。并通过激光共聚焦显微镜比较了两组DCX阳性新生神经元的数量和发育状态。异丙酚镇静组的DCX阳性细胞数在给药后14天显著减少,与BrdU阳性细胞计数的结果一致,表明该组神经前体细胞存活较少。同时,该组的新生神经元在形态学上的成熟度显著延迟。我们的结果表明异丙酚镇静组新生神经元的树突结构的复杂度,无论是在长度、分枝数目上均显著减少。在神经元的发育过程中,树突结构的复杂度是其成熟度的一个重要标志,同时也能够说明其未来的学习能力。因此,由异丙酚镇静所造成的成年神经再生能力的下降,不仅表现在神经元的数量上,而且也造成了神经元树突成熟度的下降,由此亦不难推断出其导致的行为学损害。我们观察了异丙酚重复镇静可损害大鼠空间学习和海马区成年神经再生,但异丙酚的这一作用并非通过损害成年神经干细胞增殖,而是通过影响其存活率以及新生神经元的树突结构引起的。但是异丙酚应用后所表现出的这种神经毒性的具体机制还有待于进一步研究。在本研究中我们采用蛋白质组学方法筛选异丙酚作用后对丘脑、海马、额叶中磷酸化蛋白的差异表达,经过生物信息学分析和Western Blot验证去探讨异丙酚可能的作用机制。实验结果发现异丙酚作用后有16种磷酸化蛋白表达水平存在差异,对差异表达的磷酸化蛋白进行生物信息学分析后,共发现6种蛋白质：细胞角蛋白18(KRT18)、凝溶胶蛋白(GSN)、微管蛋白(TbB2C)、巨噬细胞加帽蛋白(MCP)、肌动蛋白(Actin)及载脂蛋白E(ApoE)可能与异丙酚的神经毒性作用相关,这些蛋白质直接或间接的参与构成了细胞骨架及其稳定性的维持。Tau蛋白是中枢神经系统神经元内富含的II型微管结合蛋白(MAPs),它的磷酸化状态可被一群特定的磷酸酶和磷酸激酶调节,这些酶对维持神经元的功能和发育有重要作用。Tau蛋白的高度磷酸化被认为与阿尔茨海默病(AD)和术后认知功能障碍的发病机制相联系。七氟醚、异氟醚和异丙酚均可导致tau蛋白高度磷酸化,这可能可以解释术后认知功能障碍的发生。ApoE也可在AD患者特有的淀粉样斑块和神经纤维缠结中检测到,参与AD的发病过程。ApoE4转基因小鼠脑内过度磷酸化的Tau蛋白的单体和多体的沉积表明ApoE能够影响tau磷酸化的水平。我们推测异丙酚麻醉引起的术后认知功能障碍可能是由于血清ApoE水平变化导致的。然而这些因素的相互关系和ApoE磷酸化是否参与这个过程是未来需要探索的。生物信息学分析显示GSN和KRT18对酒精有反应。酒精能够削弱机体对外界刺激的反应,类似于异丙酚麻醉后出现的行为学改变。氨基酸神经递质受体在酒精依赖中起重要作用。酒精是GABA受体激动剂和NMDA受体拮抗剂,在大脑发育期通过抑制ERK磷酸化从而导致神经系统的退行性变。大脑发育期酒精对大脑干细胞凋亡的影响作用也类似于异丙酚。海马是大脑对酒精损害最敏感的区域,也是异丙酚麻醉作用的靶区域,谷氨酸是海马环路输入和输出的主要神经递质。总之,异丙酚的靶向区域和对信号传递的影响都与酒精相似。研究还表明酒精可能引起肝肾KRT18的磷酸化。我们的研究发现,相比对照组,异丙酚给药组的大鼠海马区KRT18也发生了磷酸化改变。但是,具体的作用机制还需要进一步研究。总而言之,本研究采用蛋白质组学方法发现了丘脑、海马、额叶的16种差异表达的磷酸化蛋白。同时使用生物信息学分析差异表达的磷酸化蛋白的共同特征去探讨异丙酚作用于神经系统的可能机制为进一步阐明异丙酚的神经毒性机制提供了很有意义的参考。结论1.Morris水迷宫实验表明异丙酚重复镇静可损害大鼠空间学习记忆能力,还可造成海马齿状回区的新生神经元的数量下降以及树突发育的不成熟,进而损害学习记忆能力。2.异丙酚麻醉作用后可引起丘脑、海马、额叶的KRT18,GSN, TbB2C, MCP,肌动蛋白,ApoE等细胞骨架蛋白质的差异表达,这种异丙酚引起的蛋白质磷酸化为未来研究异丙酚的神经毒性机制提供了支持。