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以木质纤维素为原料的二代燃料乙醇生产工艺流程中,其上游工艺产生的毒性物质对发酵微生物的抑制作用一直是产业化推进的瓶颈问题之一。酚类物质是纤维素预处理过程产生的毒性最强、种类最复杂的一类微生物生长抑制物,香草醛是其中的典型代表,研究酿酒酵母对香草醛的耐受性机制,对酿酒酵母在二代燃料乙醇中应用及其作为高抗性底盘细胞具有重要的理论意义和应用价值。本课题组在前期研究中,发现多药耐受性转录因子基因YRR1缺失能够显著提高酿酒酵母的香草醛耐受性。进一步分析表明,YRR1缺失能够解除香草醛对蛋白质翻译进程的抑制有关。基于此,本论文以YRR1缺失菌株BY4741(yrr1Δ)及其野生型菌株BY4741为研究对象,开展转录因子Yrr1p调控酿酒酵母香草醛耐受性分子机制的研究,主要研究成果有:(1)Yrr1p同源转录因子及其上级激活转录因子不影响酿酒酵母香草醛耐受性。Yrr1p在酿酒酵母中存在两个结构高度同源,调控相似靶基因的转录因子Yrm1p和Pdr8p,分别在菌株BY4741和BY4741(yrr1Δ)中,破坏了Yrm1p和Pdr8p,结果均没有改变香草醛耐受性,说明Yrr1p与这两个同源转录因子的调控功能存在显著差异。Yrr1p的上级激活转录因子的缺失理论上能够造成Yrr1p表达量下降,但破坏其上游激活因子Pdr1p、Pdr3p,并没有引起菌株的香草醛耐受性发生变化,推测存在其它上级激活因子。(2)香草醛主要抑制核糖体及氨基酸代谢相关蛋白的合成,刺激能量代谢途径的蛋白质合成。对酿酒酵母菌株BY4741在有无香草醛胁迫下的进行蛋白质组学分析,结果表明,香草醛扰动引起218个蛋白表达量发生改变。含量明显下降的蛋白质主要富集在核糖体及苯丙氨酸、丙氨酸和天冬氨酸等氨基酸代谢途径。而涉及能量代谢的氧化磷酸化、糖酵解和磷酸戊糖代谢途径的关键酶蛋白水平发生明显升高。(3)Yrr1p缺失引起细胞蛋白质翻译、基础转录和压力应激相关的蛋白表达升高。在无香草醛胁迫条件下,对菌株BY4741(yrr1Δ)和BY4741进行蛋白质组学分析,结果显示,Yrr1p缺失引起121个蛋白表达量发生改变。表达量上调的蛋白主要富集在r RNA加工、核糖体合成、翻译调控、基础转录及应激反应等生物学过程。依据相关蛋白的生物学功能,从中筛选12个候选基因在BY4741中超表达。结果显示,与亲本菌株相比,只有转录辅因子Mbf1p、蛋白酶体装配因子Tma17p和压力应激转录因子Haa1p,表现出提高了细胞对香草醛的耐受性,最大比生长速率分别提高了15%、33%和18%。而我们关注的与翻译过程相关基因的超表达对提高香草醛耐受性却没有作用。同时,Yrr1p缺失引起上调的热激蛋白Hsp12p和参与RNA代谢的Rtc3p与香草醛扰动发生相反变化,而测试结果表明这两个因子对提高香草醛耐受性也没有作用。(4)提高胞内多胺合成基因SPE1及核糖体小亚基RPS21A蛋白水平可增强香草醛耐受性。分析菌株BY4741(yrr1Δ)与BY4741在香草醛胁迫下的差异表达蛋白,结果显示,在此状态下的Yrr1p缺失引起83个蛋白表达量发生改变,上调表达的25个蛋白主要富集在ABC结合转运蛋白(ATP-binding cassette transporter),氨基酸代谢,嘌呤代谢,蛋白质翻译和蛋白质修饰相关蛋白五类,依据相关蛋白的功能,选择变化显著的鸟氨酸脱羧酶Spe1p、核糖体小亚基Rps21ap和组蛋白修饰酶Swd2p为候选基因。在BY4741菌株中分别超表达这三个因子,与亲本菌株相比,在香草醛胁迫下,超表达SPE1和RPS21A提高了菌株对香草醛的耐受性,最大比生长速率分别提高50%和11.4%。该研究结果对Yrr1p缺失提高对抑制物的耐受性分子机制有了进一步认识,同时挖掘一系列香草醛抗性元件,对构建香草醛高抗性菌株具有指导意义。