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中国是世界柑橘的主要起源地之一,品种资源丰富,近二十年来,我国柑橘产业发展迅速,2010年全国栽培柑橘面积221.2万公顷,产量2645万吨,无论是面积还是产量均居世界第一。柑橘类水果不仅营养成分丰富,而且富含类黄酮等多种活性成分,是提取和生产植物源生物活性物质的重要来源之一。柚原产我国,自然杂种及选育品种众多,柚果实中含有丰富的生物活性物质如酚酸、类黄酮等,其中类黄酮具有重要生物活性及保健功能。有关柑桔类黄酮的检测分析、活性评价和利用已成为目前研究的热点,但对我国特有柚类及柚杂种资源类黄酮的系统研究还未见报道。利用现代仪器分析和体外抗氧化测定技术,系统对我国特有柚类果实的类黄酮种类及含量进行测定分析,并探讨其抗氧化活性与类黄酮等组分之间的相关性,这对建立我国柚类资源类黄酮数据库,筛选富含类黄酮的我国柑橘资源品种,促进我国特有柑橘资源的综合开发利用都具有一定的指导意义。
本研究选择国家柑橘种质资源圃(重庆)的32个柚、葡萄柚品种以及2个柚杂种不同成熟期的果实为对象,优化建立了快速检测柑橘类黄酮的超高效液相色谱(UPLC)方法,对其果实中的类黄酮种类及含量、果实提取物的抗氧化活性以及果实的理化品质进行了分析,探讨了不同种类、不同成熟期、不同果实部位的类黄酮分布规律及果实提取物的抗氧化活性,初步分析了类黄酮遗传机制及类黄酮与果实品质、柑橘品种之间的相互关系。具体研究结果如下:
(1)建立了一种分析测试柑橘果实中类黄酮的超高效液相色谱法,能在11min内分离测定柑橘果皮及果肉中的11种类黄酮。具体技术参数如下:色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18分析柱(2.1 mm×100 mm,1.7μm);流动相:0.1%乙酸水溶液(A)和甲醇(B),采用梯度洗脱,洗脱程序为:(1)0-5 min,90%-80% A;(2)5-10 min,80%-30% A;(3)10-15 min,30%-20% A;(4)15-16 min,20%-90% A;柱温:35℃;流速:0.3 mL·min-1。11种类黄酮在11分钟内得到完全分离,各峰之间分离度R在1.80-7.02之间,各类黄酮的检出限在0.05-0.13μg/mL,定量限在0.08-0.35μg·mL-1,RSD在0.89%-5.93%,回收率居于85.4%-114.0%。该方法快速、准确、灵敏度高、有机溶剂用量少。
(2)分析了国家柑橘种质资源圃的32个柚及葡萄柚、2个柚杂种果实不同成熟期的类黄酮种类和含量。结果表明:柚类果实中类黄酮含量丰富,各品种果实果皮中的类黄酮含量都显著高于果肉,未成熟期类黄酮含量高于成熟期。在柚果实中以累积柚皮苷、芸香柚皮苷、圣草枸橼苷、新橙皮苷、柚皮素5种类黄酮为主,葡萄柚果实中以柚皮苷、新橙皮苷、芸香柚皮苷、圣草枸橼苷、橙皮苷、香风草苷、柚皮素、橙皮素、川皮苷、橘黄酮10种类黄酮为主。瑞红果实果皮、果肉中柚皮苷含量最高,未成熟期果皮为23377.61 mg/kg,成熟期果皮为9871.69mg/kg,果肉为4166.19 mg/kg;新橙皮苷在未成熟期含量最高为鸡尾果皮(12828.41mg/kg),成熟期果皮含量最高为鸡尾(7011.15 mg/kg)果肉含量最高为常山胡柚(3121.72mg/kg)。华蓥山柚为普通柚里所含类黄酮种类数量最多的一种,在未成熟果中含11种中的9种。杂种枳壳×沙田柚类果实共检测到9种类黄酮,其中以芸香柚皮苷含量最高,分别为果皮(9020mg/kg)、果肉(1240mg/kg);垫江白柚×沙田柚的类黄酮累积规律与柚类相似,说明杂种后代的类黄酮含量可能受其亲本尤其是父本影响较大。
(3)分析了32个品种不同成熟期果实的抗氧化活性,评价方法分别为DPPH法、ABTS法及Fenton反应法。3种评价方法中以清除ABTS·自由基的能力最强。未成熟期果皮的抗氧化活性略高于成熟期果皮;成熟期果皮抗氧化活性高于果肉。32个品种均表现出较强的对DPPH·自由基的清除能力,在未成熟期,测定值在32.33~65.21 VCE/100 ml的范围。果实成熟以后在31.93~55.53VCE/100 ml之间;对ABTS·的清除能力,综合未成熟期和成熟期考虑,为华蓥山柚为最高,分别为83.40%、82.51%;对·OH自由基的清除能力,结果显示为三个葡萄柚品种测定值较高,综合三种评价方法可得出,瑞红、鸡尾、常山胡柚、华蓥山柚的果皮提取物对三种自由基清除能力较强,抗氧化活性较高。
(4)分析了32个柚及葡萄柚品种的总糖、还原糖、蔗糖、可滴定酸和维生素C,运用主成分分析法分析了各样品的主成分分值。品质分析的结果显示,柚类果实与其他柑橘种类相比具有糖含量高,可滴定酸含量较低,维生素C含量特别丰富的特点,总糖含量最高为琯溪蜜柚、东风早(10.70 g/100g),3个葡萄柚果实酸度较高,维生素C含量最高为鸡尾葡萄柚(105mg/100g)。相关性分析表明,类黄酮、维生素C含量与抗氧化活性呈正相关。