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第一部分:口腔、口咽及唇癌术前NLR、PLR的预后预测意义研究
研究背景:
头颈癌是全球第六大肿瘤，其中口腔、口咽及唇癌是最常见的头颈癌。2018年全球癌症数据报道口腔及唇癌有354864例新发病例和177384例死亡病例，口咽癌有92887例新发病例及51005例死亡病例，且呈现逐年上升的趋势。尽管头颈癌治疗技术在不断的发展，特别是基于局部免疫微环境及炎性状态调节的免疫治疗技术发展，头颈癌的5年生存率有所提高，但仍然是近20年来5生存率提高较慢的肿瘤之一(＜5％)。随着对肿瘤临床及肿瘤生物学特性的研究发现，基于传统的TNM分期的癌症预后预测分析的精确性不够，如早期的结直肠癌患者中约有25％的人预后不良，对头颈癌的分析也发现有一定比例的早期患者预后差。对癌症患者的大数据研究也发现，许多相同TNM分期的癌症患者对放化疗及免疫治疗等应答性有显著的差异，大大影响了临床疗效的提高及副作用的控制。因此，探寻解决补充肿瘤TNM分期信息的不完整性，提高癌症患者的精准预后预测是肿瘤临床研究的重要内容之一。
随着对炎症与肿瘤进展、治疗应答及预后预测关系的研究发现，许多实体肿瘤的炎性状态及类型不仅与其进展、放化疗及免疫治疗应答的敏感性有关，且对基于TNM的预后预测的精确性显示出了良好的补充价值。荷瘤宿主的炎性环境包括系统炎性标志及肿瘤局部的炎性微环境，其中，探索系统炎性标志对肿瘤预后及其治疗应答反应的预测意义，不仅是肿瘤预后预测研究领域的重要内容之一，也是肿瘤治疗应答敏感性研究的热点内容之一。中性粒细胞(Polymorphonuclear，PMN)是人类外周血中最丰富的细胞类型，占循环白细胞的50-70％，是抵御微生物入侵的第一道防线。许多的研究发现，系统性炎性标志物包括PMN及其相应的比值如中性粒细胞-淋巴细胞比率(Neutrophil lymphocyte ratio，NLR)、血小板-淋巴细胞比率(Platelet lymphocyte ratio，PLR)等，不仅与心血管疾病的事件如动脉粥样硬化斑块稳定性、心肌梗塞预后有关，还与许多炎性疾病的并发症发生有关，如细菌性感染休克的预测。还有研究发现，系统性炎性标志与免疫相关性疾病的发生如大脑多区域神经退行性变导致的阿尔茨海默氏症的出现。
基于炎症与肿瘤进展及预后的关系，大量的研究分析了肿瘤患者系统性炎性标志物对其预后的影响，如NLRhi和或PLRhi与胃癌、结直肠癌、肝癌及非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤的不良预后有关，并具有独立预后意义，且系统性炎症标志物的这一不良预后的预测意义可以通过PMN促肿瘤炎症的作用来解释。新近的研究发现，非小细胞肺癌的NLR高低对PD-1/PD-L1阻断治疗的有预测意义，对肾癌的研究中也发现NLR不仅与预后有关，其动态变化还与PD-1抑制剂的疗效有关。越来越多的证据表明系统炎性标志物在肿瘤预后及治疗应答预测中均具有重要意义。口腔癌、口咽癌及唇癌是最重要的头颈癌，然而其风险因素和生物学行为却相差甚远，虽有研究报道发现NLR、PLR与头颈部鳞状细胞癌的生物学行为及其预后密切相关，但有关口腔癌、口咽癌及唇癌患者NLR、PLR与其进展及预后的关系的数据较少且存在分歧。本研究纳入了山东大学齐鲁医院的421例以上三种头颈癌作为队列，采用包括作为系统性炎性标志物的术前NLR和PLR在内的多变量分析，分析了其与生存和复发的关系，并对NLRhi和PLRhi的患者进行亚组分析，同时进一步探索了这部分患者在放化疗干预后的生存与复发的差异。本项研究的结果为口腔癌、口咽癌及唇癌患者基于系统炎性标志NLR、PLR的预后预测价值及意义提供了新的队列分析结果和新的发现，也为以上三种头颈癌的预后预测研究及分层治疗管理提供了新的依据。
研究目的
分析阐述系统性炎性标志物NLR和PLR与口腔癌、口咽癌及唇癌患者的临床病理学指标的关系;分析NLR和PLR在此三种头颈癌的生存预测价值及其独立预后意义;分析NLR和PLR与此三种头颈癌复发转移的关系;对NLRhi和PLRhi的患者进行亚组分析，探索这部分患者进一步放化疗干预后的生存预测价值与复发转移的差异，以期为口腔癌、口咽癌及唇癌的预后预测及分层治疗管理的研究提供新的依据。
研究方法
1.基于山东大学齐鲁医院口腔科收治并手术的口腔、口咽及唇癌患者421例建立队列，收集整理并统计患者的临床病理资料包括:性别、年龄、肿瘤类型、是否吸烟或饮酒、组织学分化程度(仅鳞癌纳入分析)、术前NLR及PLR值，并依据病理学及影像学依据，按照口腔、口咽及唇癌TNM分期(AJCC第七版)标准进行临床病理学分期。
2.依据接收者操作特征曲线(Receiver operating characteristic，ROC)确定NLR、PLR的最佳临界值，曲线上数值符合最大约登指数(灵敏度/0.44+特异度/0.84-1)对应数值为最佳临界值，并进行分层分析。
3.421例患者进行临床病理资料与NLR、PLR进行相关性分析。195例具有1年以上最终随访结果的患者进行的总生存时间(OS)和无复发生存时间(RFS)的单因素及多因素生存分析，并对比复发转移率及原位复发率情况。
4.对NLRhi和PLRhi的患者进行亚组分析，探索亚组人群中进一步放化疗干预后的生存预后意义，对比是否采取放化疗患者的复发转移的差异。
5.采用SPSS21.0进行统计学分析，生存曲线及复发率图形绘制采用GraphPadPrism7进行，率的比较使用卡方检验，相关性比较使用Spearman相关系数(rs范围为-1到+1);总生存及无复发生存使用Kaplan-Meier生存分析法(logrank检验)，COX比例风险模型进行单因素及多因素分析。
研究结果
1.NLRhi与肿瘤大小(P＜0.001)和TNM分期(P=0.002)具有正相关性，NLR与年龄分组、性别、是否吸烟或饮酒、组织学分级、颈部淋巴结转移均无显著相关性。
2.PLRhi与肿瘤大小(P＜0.001)和TNM分期(P=0.008)具有正相关性，另外，PLRhi与男性(P=0.03)及吸烟或饮酒有关(P=0.02)，PLR与年龄、组织学分级、颈部淋巴结转移均无显著相关。
3.生存分析:单因素生存分析提示NLRhi患者的OS(中位生存时间/月，31.3vs42.5，P=0.02)及RFS(中位生存时间/月，29.8vs40.6，P=0.009)均更差，PLRhi与PLRlow患者的OS及RFS无显著差异;肿瘤较大者OS(P=0.02)及RFS(P=0.02)短于肿瘤较小者;TNM分期较晚者的OS(P=0.01)及RFS(P=0.01)均较差;颈部淋巴结转移阳性的患者RFS较短(P=0.03)，OS无差异。性别、年龄、组织学分化程度及是否行术后放化疗对口腔、口咽及唇癌患者OS、RFS均无明显影响。多因素生存分析提示术前NLRhi是OS(HR=1.709，P=0.014)及RFS(HR=1.598，P=0.032)的独立预后因素，其他因素包括肿瘤大小、颈部淋巴结转移及TNM分期均无显著差异。
4.复发率:NLRhi患者的总体复发率(P=0.03)及原位复发率(P=0.02)均明显高于NLRlow患者，NLRhi患者颈部淋巴结转移与NLRlow患者无显著差异;PLRhi患者总体复发、原位复发及颈部淋巴结转移与PLRlow患者比较均无显著差异。
5.NLRhi与PLRhi亚组分析:35例NLRhi患者进行术后放化疗与未行放化疗者比较OS及RFS无显著差异，NLRhi患者进行术后放化疗者复发转移率明显低于未行放化疗者(P=0.027)。66例PLRhi患者进行术后放化疗与未行放化疗者比较OS及RFS无显著差异，PLRhi患者进行术后放化疗者复发转移率与未行放化疗者无显著差异。
研究结论
1.口腔癌、口咽癌和唇癌是最重要的头颈癌，其风险因素和生物学行为却相去甚远，且其预后的说法尚不统一，本研究对口腔癌、口咽癌和唇癌三种头颈癌的一项包含421例患者的大型队列研究，通过生存分析发现术前NLR是预测头颈癌预后的独立风险因素，PLR对生存预后无显著影响意义。
2.我们的研究发现NLRhi与高复发风险尤其原位复发有关，PLR与复发风险无显著相关，提示NLR可能预测头颈癌的复发，为评估术后复发风险提供预测依据。
3.NLR、PLR与肿瘤大小及TNM分期正相关，进行亚组分析中NLRhi的患者进行放化疗干预后复发率明显降低，提示NLR及PLR可能为头颈癌的分层治疗管理提供有价值的数据依据。
第二部分:口腔及口咽癌CD15+中性粒细胞浸润与NLR关系的分析及MDA5表达对其临床病理指标及预后的影响意义研究
研究背景:
肿瘤炎性微环境的形成及调节机制，是近年来基于靶向免疫微环境的治疗及其预后预测意义的主要研究内容之一。近年来，随着对肿瘤微环境的构成与其预后及治疗应答性预测研究领域的拓展及深入，大量的研究显示，许多实体肿瘤包括头颈肿瘤微环境存在多种免疫细胞且具有高度的异质性。对癌症的免疫微环境构成及其异质性的研究，以及炎症浸润特征与其预后预测价值是当前肿瘤精准预测及治疗研究的重要内容之一。近年来，CD15+中性粒细胞作为机体天然免疫的先期反应细胞，其浸润特征及其与局部天然免疫应答启动、肿瘤进展调控及其预后预测价值备受重视。已有的研究证实PMN参与介导多种生理及病理生理过程及炎症性疾病如组织重塑、血管新生、胚胎植入、组织炎症等，是机体关键的天然免疫反应细胞。肿瘤浸润的PMN也称为肿瘤相关中性粒细胞(Tumor-associated neutrophils，TANs)是肿瘤炎症微环境的重要组分，在肺癌、乳腺癌、胃癌、黑色素瘤、肾细胞癌、结直肠癌以及头颈癌等许多实体瘤中，均发现TANs浸润且有较高异质性，对其预后预测价值的临床意义的研究存在异同。最新的研究发现TANs的浸润对免疫检查点PD-1抑制剂的疗效具有影响意义，因此揭示肿瘤局部PMN浸润的特征及其意义已成为肿瘤炎性微环境研究的新的热点之一。
在针对肿瘤的天然免疫中，与PMN的前期浸润相伴随的是固有免疫的关键“预警”系统——模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)的启动，其在局部炎性反应中的作用及临床意义备受关注。黑色素瘤分化相关蛋白5(Melanoma differentiation-associated protein 5，MDA5)是最重要的模式识别受体之一，其不仅是机体识别微环境中危险信号(病原等)，快速启动炎性应答，而且在许多的炎性疾病中起重要作用。已有研究发现，MDA5介导的炎性细胞浸润调控肺部炎性疾病的发展，如在慢性肺炎的小鼠模型研究中发现其炎症进展中，MDA5的缺失可导致中性粒细胞及相应趋化因子的减少，进而调节中性粒细胞等介导的早期炎症反应，调控慢性肺部炎症的发展。新近研究发现MDA5与黑色素瘤、胰腺癌及神经母细胞瘤等恶性肿瘤的进展抑制有关，且具有预后预测价值，然而其表达与恶性肿瘤PMN的浸润及其临床意义鲜有报道，目前尚无关于MDA5与口腔及口咽癌关系的分析研究，尚不清楚MDA5的表达与口腔及口咽及口咽癌局部PMN浸润是否有关，是否有预后预测价值。解析口腔及口咽癌炎性环境的早期反应细胞PMN和早期应答分子MDA5及其临床意义，对基于肿瘤炎性特征微环境的肿瘤治疗及其预后预测将提供新的数据及防治策略。
基于上述的分析，本研究利用TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)下载了288例口腔癌的CD15及MDA5表达情况和临床病理学数据，并对CD15及MDA5表达相关性与临床意义进行了分析。利用免疫组织化学染色技术，对齐鲁医院158例具有一年以上生存资料的口腔及口咽癌患者组织切片，进行了CD15及MDA5表达分析及其临床意义的分析，同时进一步分析了肿瘤局部CD15+中性粒细胞浸润与其对应的术前NLR的关系及其临床意义。本研究结果以期为基于天然应答的早期反应细胞与分子——中性粒细胞及MDA5的口腔及口咽癌的精确预测提供新的数据。
研究目的
从TCGA数据库下载288例口腔癌的CD15及MDA5表达情况和临床病理学数据，并对CD15及MDA5表达相关性与临床意义进行了分析。以期为提高天然免疫标志的预后预测价值及治疗策略的选择提供新的线索和依据。
基于158例口腔及口咽癌患者建立队列研究，利用免疫组化法检测CD15+中性粒细胞的浸润及MDA5表达，分析其表达特点与临床病理特征的关系及预后影响意义，同时进一步分析了局部CD15+中性粒细胞浸润联合NLR对预后预测的意义，以期为基于天然应答的早期反应细胞与分子——中性粒细胞及MDA5的口腔及口咽癌的精确预测提供新的数据，并为基于中性粒细胞、MDA5的免疫治疗策略的开展提供新的数据支持。
研究方法
1.从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库(https://portal.gdc.can cer.gov/)下载了288例口腔癌患者的临床病理学资料及CD15和MDA5表达数据，CD15及MDA5按照其表达的中位数进行分层分析，分析CD15、MDA5与临床指标的相关性及预后意义。
2.收集2006年1月1日-2013年12月31日于山东大学齐鲁医院口腔科收治并首次接受手术的158例口腔、口咽癌患者的病理标本，建立患者的临床病理资料数据库，包括性别、年龄、吸烟或饮酒史、肿瘤部位、分化程度(其中仅对129例鳞状细胞癌患者进行分析描述)，并依据病理学及影像学依据，按照口腔、口咽癌TNM分期(AJCC第七版)标准进行临床病理学分期，并对所有患者进行电话随访。
3.免疫组化:利用免疫组化法检测158例标本的CD15+中性粒细胞的浸润及MDA5的表达特点。显微镜下观察CD15阳性表达呈现为棕黄色的颗粒，并且基本都位于细胞的胞浆内。在高倍镜视野(HPF)热点区域进行CD15+中性粒细胞计数，计三个区域阳性细胞数取平均值，作为每个标本内浸润的CD15+中性粒细胞数。分别观察所有标本的瘤内、交界区、基质3个区域的CD15+中性粒细胞浸润细胞数，计算各区域阳性细胞数的中位数作为其临界值(cut off point)，高于临界值表示为CD15+hi，低于临界值表示为CD15+low，以此进行分层分析。MDA5在肿瘤细胞及成纤维细胞的胞浆着色为主，淋巴细胞，血管内皮等均不着色。分别观察MDA5在肿瘤内和周围基质两个区域的表达，其染色强度:不着色，0分;弱染色，1分;中等强度，2分;强染色，3分。染色细胞数(阳性率)占总肿瘤细胞百分比:0-5％，0分;6-25％，1分;26-50％，2分;51-75％，3分;75％以上，4分。因MDA5表达强度尚无统一标准，本研究进行强度及阳性率分层分析:染色强度为2-3分、阳性率为3-4分为高表达，染色强度0-1分、阳性率0-2分为低表达。
4.依据接收者操作特征曲线(Receiver operating characteristic，ROC)确定本队列158例口腔及口咽癌的NLR最佳临界值，曲线上数值符合最大约登指数(灵敏度/0.44+特异度/0.84-1)对应数值为最佳临界值，并进行分层分析。
5.统计学方法:采用SPSS21.0进行统计学分析，生存曲线及森林图使用GraphPadPrism7进行绘制。利用t检验分析CD15+中性粒细胞在三个区域的浸润深度差异，卡方检验分析MDA5瘤内和基质区表达差异;利用最佳临界值进行CD15+中性粒细胞浸润分层，Spearman相关系数分析CD15+中性粒细胞浸润及MDA5与临床病理指标的关系(rs范围为-1到+1)。Kaplan-Meier生存分析法(logrank检验)进行单因素生存分析，COX比例风险模型进行多因素分析。
研究结果
1.TCGA数据库分析:从TCGA数据库下载288例口腔癌患者数据建立队列研究，分析结果显示CD15与MDA5表达无显著相关性(rs=-0.020，P=0.729)。CD15的表达与原发肿瘤部位(CD15hi舌部比例最高，P=0.036)、组织学分级(CD15hi的患者组织学分级更高，分化更差，P=0.023)及是否行放化疗(CD15hi的患者更多的进行放化疗干预，P=0.033)显著相关，与年龄、性别、吸烟史、饮酒史、TNM分期及是否进行颈部淋巴结清扫无关。MDA5高表达者以女性患者比例更高(P＜0.001)，MDA5表达与其他临床指标均无关。单因素生存分析提示早期患者3年生存率较高(P=0.024)，CD15hi的患者3年生存率高于CD15low者(P=0.012)，MDA5与生存预后无显著相关。多因素分析提示年龄(P=0.025)、TNM分期(P＜0.001)、组织学分级(P=0.004)及是否行颈淋巴结清扫(P＜0.001)均与3年OS有关，CD15及MDA5不同表达3年OS无显著差异。
2.以下结果基于158例口腔及口咽癌患者队列进行分析:CD15+中性粒细胞在瘤内、交界及基质不同区域的浸润具有高度异质性。肿瘤基质中的CD15+中性粒细胞浸润最高(74/HPF，18-152/HPF)，在瘤内(37/HPF，7-84/HPF)及交界区(41/HPF，11-104/H PF)相对较低(P＜0.001)。
3.CD15+hi与临床病理学指标的关系:肿瘤内CD15+hi与TNM分期正相关(rs=0.179，P=0.025)，交界区CD15+hi在口腔癌中比例高于口咽癌(P=0.023);三个区域的CD15hi与年龄、性别、是否吸烟或饮酒、组织学分级、肿瘤大小及颈部淋巴结转移均无显著相关。
4.MDA5表达在肿瘤不同部位存在异质性:MDA5主要在肿瘤组织内高表达，基质内表达强度及阳性率均较低。瘤内MDA5强度高于肿瘤基质内(2-3分表达率，58.2％vs19.6％，P＜0.001)，瘤内MDA5阳性率高于肿瘤基质内(3-4分表达率，60.8％vs14.6％，P=0.005)。
5.MDA5表达与临床病理学指标关系:瘤内MDA5高表达与颈部淋巴结转移(rs=0.166，P=0.037)、TNM分期(rs=0.167，P=0.036)正相关，与组织学分化负相关(高分化比例48.8％vs30.6％，rs=-0.211，P=0.017)，与年龄、性别、是否吸烟或饮酒、肿瘤部位、组织学分级及肿瘤大小中均无显著相关。肿瘤基质中MDA5表达均与各临床病理学指标无显著相关。
6.生存分析:单因素生存分析提示基质内CD15+hi者OS(中位生存/月CD15+hivsCD15+low31.7vs46.3，P＜0.001)及RFS(中位生存/月CD15+hivsCD15+low31.0vs43.4，P=0.001)均较差，TNM分期较晚者RFS更差(中位生存/月Ⅲ-Ⅳ期vsⅠ-Ⅱ期32.6vs41.1P=0.039)，OS无显著差异;瘤内CD15+hi及交界区CD15+hi对OS及RFS无显著影响，其它临床病理学指标及瘤内、基质内MDA5表达均对OS及RFS无显著影响;多因素分析提示基质内CD15+hi是OS(HR=1.853，P＜0.001)及RFS(HR=1.664，P=0.003)的独立预后因素。
7.NLR与CD15+中性粒细胞相关性及其联合预后预测意义:NLRhi者与肿瘤内(P=0.081，rs=0.139)、交界(P=0.135，rs=0.119)及基质(P=0.520，rs=0.052)CD15+中性粒细胞浸润均无显著相关。NLRhi者OS(中位生存时间/月，33.1vs43.0，P=0.019)及RFS(中位生存时间/月，31.3vs41.2，P=0.019)均显著低于NLRlow者，联合NLR及基质CD15+中性粒细胞浸润进行生存分析提示NLRhi和/或基质CD15+hi患者的OS(中位生存时间/月，33.3vs51.7，P＜0.001)及RFS(中位生存时间/月，32.0vs48.8，P=0.001)均差，且联合生存分析P值更低，差异性更显著。
8.CD15+hi与MDA5表达无显著相关性:瘤内CD15+hi与瘤内MDA5强度(强度低vs强度高50.0％vs51.1％，rs=0.011P=0.894)及阳性率(阳性率高vs阳性率低53.2％vs49.0％，rs=-0.042P=0.603)均无显著差异;基质内CD15+hi与基质内MDA5强度(强度低vs强度高49.6％vs51.6％，rs=0.016P=0.842)及阳性率(阳性率低vs阳性率高48.1％vs60.9％，rs=0.090P=0.262)均无显著差异。
研究结论
1.对口腔及口咽癌此两种重要头颈癌进行肿瘤中不同部位CD15+中性粒细胞浸润特点的研究，发现CD15+中性粒细胞浸润有高度异质性，在肿瘤基质内浸润最高。癌巢区CD15+hi与TNM分期正相关，而基质内CD15+hi是OS及RFS的的独立预后因素，提示在此两种头颈癌的基质内CD15+中性粒细胞浸润具有预后影响意义。
2.首次对此两种头颈癌进行MDA5表达的观察研究，发现MDA5主要表达在的肿瘤组织内;瘤内MDA5表达与组织学分化、TNM分期和颈淋巴结转移相关，提示其在肿瘤进展过程中可能具有重要作用。
3.循环标志物NLRhi和/或局部基质CD15+hi者的OS及RFS均较差，且较单纯NLRhi生存差异更显著，提示联合检测局部中性粒细胞浸润及循环炎性标志物可能更好的预测预后，为精准预后预测提供依据。
4.首次进行此两种头颈癌肿瘤内及基质内CD15+中性粒细胞浸润与MDA5表达的相关性研究，发现两者无显著相关性，以期在进一步体外及动物模型实验中呈现出更多的结果并逐步转化为临床应用。
研究背景:
头颈癌是全球第六大肿瘤，其中口腔、口咽及唇癌是最常见的头颈癌。2018年全球癌症数据报道口腔及唇癌有354864例新发病例和177384例死亡病例，口咽癌有92887例新发病例及51005例死亡病例，且呈现逐年上升的趋势。尽管头颈癌治疗技术在不断的发展，特别是基于局部免疫微环境及炎性状态调节的免疫治疗技术发展，头颈癌的5年生存率有所提高，但仍然是近20年来5生存率提高较慢的肿瘤之一(＜5％)。随着对肿瘤临床及肿瘤生物学特性的研究发现，基于传统的TNM分期的癌症预后预测分析的精确性不够，如早期的结直肠癌患者中约有25％的人预后不良，对头颈癌的分析也发现有一定比例的早期患者预后差。对癌症患者的大数据研究也发现，许多相同TNM分期的癌症患者对放化疗及免疫治疗等应答性有显著的差异，大大影响了临床疗效的提高及副作用的控制。因此，探寻解决补充肿瘤TNM分期信息的不完整性，提高癌症患者的精准预后预测是肿瘤临床研究的重要内容之一。
随着对炎症与肿瘤进展、治疗应答及预后预测关系的研究发现，许多实体肿瘤的炎性状态及类型不仅与其进展、放化疗及免疫治疗应答的敏感性有关，且对基于TNM的预后预测的精确性显示出了良好的补充价值。荷瘤宿主的炎性环境包括系统炎性标志及肿瘤局部的炎性微环境，其中，探索系统炎性标志对肿瘤预后及其治疗应答反应的预测意义，不仅是肿瘤预后预测研究领域的重要内容之一，也是肿瘤治疗应答敏感性研究的热点内容之一。中性粒细胞(Polymorphonuclear，PMN)是人类外周血中最丰富的细胞类型，占循环白细胞的50-70％，是抵御微生物入侵的第一道防线。许多的研究发现，系统性炎性标志物包括PMN及其相应的比值如中性粒细胞-淋巴细胞比率(Neutrophil lymphocyte ratio，NLR)、血小板-淋巴细胞比率(Platelet lymphocyte ratio，PLR)等，不仅与心血管疾病的事件如动脉粥样硬化斑块稳定性、心肌梗塞预后有关，还与许多炎性疾病的并发症发生有关，如细菌性感染休克的预测。还有研究发现，系统性炎性标志与免疫相关性疾病的发生如大脑多区域神经退行性变导致的阿尔茨海默氏症的出现。
基于炎症与肿瘤进展及预后的关系，大量的研究分析了肿瘤患者系统性炎性标志物对其预后的影响，如NLRhi和或PLRhi与胃癌、结直肠癌、肝癌及非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤的不良预后有关，并具有独立预后意义，且系统性炎症标志物的这一不良预后的预测意义可以通过PMN促肿瘤炎症的作用来解释。新近的研究发现，非小细胞肺癌的NLR高低对PD-1/PD-L1阻断治疗的有预测意义，对肾癌的研究中也发现NLR不仅与预后有关，其动态变化还与PD-1抑制剂的疗效有关。越来越多的证据表明系统炎性标志物在肿瘤预后及治疗应答预测中均具有重要意义。口腔癌、口咽癌及唇癌是最重要的头颈癌，然而其风险因素和生物学行为却相差甚远，虽有研究报道发现NLR、PLR与头颈部鳞状细胞癌的生物学行为及其预后密切相关，但有关口腔癌、口咽癌及唇癌患者NLR、PLR与其进展及预后的关系的数据较少且存在分歧。本研究纳入了山东大学齐鲁医院的421例以上三种头颈癌作为队列，采用包括作为系统性炎性标志物的术前NLR和PLR在内的多变量分析，分析了其与生存和复发的关系，并对NLRhi和PLRhi的患者进行亚组分析，同时进一步探索了这部分患者在放化疗干预后的生存与复发的差异。本项研究的结果为口腔癌、口咽癌及唇癌患者基于系统炎性标志NLR、PLR的预后预测价值及意义提供了新的队列分析结果和新的发现，也为以上三种头颈癌的预后预测研究及分层治疗管理提供了新的依据。
研究目的
分析阐述系统性炎性标志物NLR和PLR与口腔癌、口咽癌及唇癌患者的临床病理学指标的关系;分析NLR和PLR在此三种头颈癌的生存预测价值及其独立预后意义;分析NLR和PLR与此三种头颈癌复发转移的关系;对NLRhi和PLRhi的患者进行亚组分析，探索这部分患者进一步放化疗干预后的生存预测价值与复发转移的差异，以期为口腔癌、口咽癌及唇癌的预后预测及分层治疗管理的研究提供新的依据。
研究方法
1.基于山东大学齐鲁医院口腔科收治并手术的口腔、口咽及唇癌患者421例建立队列，收集整理并统计患者的临床病理资料包括:性别、年龄、肿瘤类型、是否吸烟或饮酒、组织学分化程度(仅鳞癌纳入分析)、术前NLR及PLR值，并依据病理学及影像学依据，按照口腔、口咽及唇癌TNM分期(AJCC第七版)标准进行临床病理学分期。
2.依据接收者操作特征曲线(Receiver operating characteristic，ROC)确定NLR、PLR的最佳临界值，曲线上数值符合最大约登指数(灵敏度/0.44+特异度/0.84-1)对应数值为最佳临界值，并进行分层分析。
3.421例患者进行临床病理资料与NLR、PLR进行相关性分析。195例具有1年以上最终随访结果的患者进行的总生存时间(OS)和无复发生存时间(RFS)的单因素及多因素生存分析，并对比复发转移率及原位复发率情况。
4.对NLRhi和PLRhi的患者进行亚组分析，探索亚组人群中进一步放化疗干预后的生存预后意义，对比是否采取放化疗患者的复发转移的差异。
5.采用SPSS21.0进行统计学分析，生存曲线及复发率图形绘制采用GraphPadPrism7进行，率的比较使用卡方检验，相关性比较使用Spearman相关系数(rs范围为-1到+1);总生存及无复发生存使用Kaplan-Meier生存分析法(logrank检验)，COX比例风险模型进行单因素及多因素分析。
研究结果
1.NLRhi与肿瘤大小(P＜0.001)和TNM分期(P=0.002)具有正相关性，NLR与年龄分组、性别、是否吸烟或饮酒、组织学分级、颈部淋巴结转移均无显著相关性。
2.PLRhi与肿瘤大小(P＜0.001)和TNM分期(P=0.008)具有正相关性，另外，PLRhi与男性(P=0.03)及吸烟或饮酒有关(P=0.02)，PLR与年龄、组织学分级、颈部淋巴结转移均无显著相关。
3.生存分析:单因素生存分析提示NLRhi患者的OS(中位生存时间/月，31.3vs42.5，P=0.02)及RFS(中位生存时间/月，29.8vs40.6，P=0.009)均更差，PLRhi与PLRlow患者的OS及RFS无显著差异;肿瘤较大者OS(P=0.02)及RFS(P=0.02)短于肿瘤较小者;TNM分期较晚者的OS(P=0.01)及RFS(P=0.01)均较差;颈部淋巴结转移阳性的患者RFS较短(P=0.03)，OS无差异。性别、年龄、组织学分化程度及是否行术后放化疗对口腔、口咽及唇癌患者OS、RFS均无明显影响。多因素生存分析提示术前NLRhi是OS(HR=1.709，P=0.014)及RFS(HR=1.598，P=0.032)的独立预后因素，其他因素包括肿瘤大小、颈部淋巴结转移及TNM分期均无显著差异。
4.复发率:NLRhi患者的总体复发率(P=0.03)及原位复发率(P=0.02)均明显高于NLRlow患者，NLRhi患者颈部淋巴结转移与NLRlow患者无显著差异;PLRhi患者总体复发、原位复发及颈部淋巴结转移与PLRlow患者比较均无显著差异。
5.NLRhi与PLRhi亚组分析:35例NLRhi患者进行术后放化疗与未行放化疗者比较OS及RFS无显著差异，NLRhi患者进行术后放化疗者复发转移率明显低于未行放化疗者(P=0.027)。66例PLRhi患者进行术后放化疗与未行放化疗者比较OS及RFS无显著差异，PLRhi患者进行术后放化疗者复发转移率与未行放化疗者无显著差异。
研究结论
1.口腔癌、口咽癌和唇癌是最重要的头颈癌，其风险因素和生物学行为却相去甚远，且其预后的说法尚不统一，本研究对口腔癌、口咽癌和唇癌三种头颈癌的一项包含421例患者的大型队列研究，通过生存分析发现术前NLR是预测头颈癌预后的独立风险因素，PLR对生存预后无显著影响意义。
2.我们的研究发现NLRhi与高复发风险尤其原位复发有关，PLR与复发风险无显著相关，提示NLR可能预测头颈癌的复发，为评估术后复发风险提供预测依据。
3.NLR、PLR与肿瘤大小及TNM分期正相关，进行亚组分析中NLRhi的患者进行放化疗干预后复发率明显降低，提示NLR及PLR可能为头颈癌的分层治疗管理提供有价值的数据依据。
第二部分:口腔及口咽癌CD15+中性粒细胞浸润与NLR关系的分析及MDA5表达对其临床病理指标及预后的影响意义研究
研究背景:
肿瘤炎性微环境的形成及调节机制，是近年来基于靶向免疫微环境的治疗及其预后预测意义的主要研究内容之一。近年来，随着对肿瘤微环境的构成与其预后及治疗应答性预测研究领域的拓展及深入，大量的研究显示，许多实体肿瘤包括头颈肿瘤微环境存在多种免疫细胞且具有高度的异质性。对癌症的免疫微环境构成及其异质性的研究，以及炎症浸润特征与其预后预测价值是当前肿瘤精准预测及治疗研究的重要内容之一。近年来，CD15+中性粒细胞作为机体天然免疫的先期反应细胞，其浸润特征及其与局部天然免疫应答启动、肿瘤进展调控及其预后预测价值备受重视。已有的研究证实PMN参与介导多种生理及病理生理过程及炎症性疾病如组织重塑、血管新生、胚胎植入、组织炎症等，是机体关键的天然免疫反应细胞。肿瘤浸润的PMN也称为肿瘤相关中性粒细胞(Tumor-associated neutrophils，TANs)是肿瘤炎症微环境的重要组分，在肺癌、乳腺癌、胃癌、黑色素瘤、肾细胞癌、结直肠癌以及头颈癌等许多实体瘤中，均发现TANs浸润且有较高异质性，对其预后预测价值的临床意义的研究存在异同。最新的研究发现TANs的浸润对免疫检查点PD-1抑制剂的疗效具有影响意义，因此揭示肿瘤局部PMN浸润的特征及其意义已成为肿瘤炎性微环境研究的新的热点之一。
在针对肿瘤的天然免疫中，与PMN的前期浸润相伴随的是固有免疫的关键“预警”系统——模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)的启动，其在局部炎性反应中的作用及临床意义备受关注。黑色素瘤分化相关蛋白5(Melanoma differentiation-associated protein 5，MDA5)是最重要的模式识别受体之一，其不仅是机体识别微环境中危险信号(病原等)，快速启动炎性应答，而且在许多的炎性疾病中起重要作用。已有研究发现，MDA5介导的炎性细胞浸润调控肺部炎性疾病的发展，如在慢性肺炎的小鼠模型研究中发现其炎症进展中，MDA5的缺失可导致中性粒细胞及相应趋化因子的减少，进而调节中性粒细胞等介导的早期炎症反应，调控慢性肺部炎症的发展。新近研究发现MDA5与黑色素瘤、胰腺癌及神经母细胞瘤等恶性肿瘤的进展抑制有关，且具有预后预测价值，然而其表达与恶性肿瘤PMN的浸润及其临床意义鲜有报道，目前尚无关于MDA5与口腔及口咽癌关系的分析研究，尚不清楚MDA5的表达与口腔及口咽及口咽癌局部PMN浸润是否有关，是否有预后预测价值。解析口腔及口咽癌炎性环境的早期反应细胞PMN和早期应答分子MDA5及其临床意义，对基于肿瘤炎性特征微环境的肿瘤治疗及其预后预测将提供新的数据及防治策略。
基于上述的分析，本研究利用TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)下载了288例口腔癌的CD15及MDA5表达情况和临床病理学数据，并对CD15及MDA5表达相关性与临床意义进行了分析。利用免疫组织化学染色技术，对齐鲁医院158例具有一年以上生存资料的口腔及口咽癌患者组织切片，进行了CD15及MDA5表达分析及其临床意义的分析，同时进一步分析了肿瘤局部CD15+中性粒细胞浸润与其对应的术前NLR的关系及其临床意义。本研究结果以期为基于天然应答的早期反应细胞与分子——中性粒细胞及MDA5的口腔及口咽癌的精确预测提供新的数据。
研究目的
从TCGA数据库下载288例口腔癌的CD15及MDA5表达情况和临床病理学数据，并对CD15及MDA5表达相关性与临床意义进行了分析。以期为提高天然免疫标志的预后预测价值及治疗策略的选择提供新的线索和依据。
基于158例口腔及口咽癌患者建立队列研究，利用免疫组化法检测CD15+中性粒细胞的浸润及MDA5表达，分析其表达特点与临床病理特征的关系及预后影响意义，同时进一步分析了局部CD15+中性粒细胞浸润联合NLR对预后预测的意义，以期为基于天然应答的早期反应细胞与分子——中性粒细胞及MDA5的口腔及口咽癌的精确预测提供新的数据，并为基于中性粒细胞、MDA5的免疫治疗策略的开展提供新的数据支持。
研究方法
1.从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库(https://portal.gdc.can cer.gov/)下载了288例口腔癌患者的临床病理学资料及CD15和MDA5表达数据，CD15及MDA5按照其表达的中位数进行分层分析，分析CD15、MDA5与临床指标的相关性及预后意义。
2.收集2006年1月1日-2013年12月31日于山东大学齐鲁医院口腔科收治并首次接受手术的158例口腔、口咽癌患者的病理标本，建立患者的临床病理资料数据库，包括性别、年龄、吸烟或饮酒史、肿瘤部位、分化程度(其中仅对129例鳞状细胞癌患者进行分析描述)，并依据病理学及影像学依据，按照口腔、口咽癌TNM分期(AJCC第七版)标准进行临床病理学分期，并对所有患者进行电话随访。
3.免疫组化:利用免疫组化法检测158例标本的CD15+中性粒细胞的浸润及MDA5的表达特点。显微镜下观察CD15阳性表达呈现为棕黄色的颗粒，并且基本都位于细胞的胞浆内。在高倍镜视野(HPF)热点区域进行CD15+中性粒细胞计数，计三个区域阳性细胞数取平均值，作为每个标本内浸润的CD15+中性粒细胞数。分别观察所有标本的瘤内、交界区、基质3个区域的CD15+中性粒细胞浸润细胞数，计算各区域阳性细胞数的中位数作为其临界值(cut off point)，高于临界值表示为CD15+hi，低于临界值表示为CD15+low，以此进行分层分析。MDA5在肿瘤细胞及成纤维细胞的胞浆着色为主，淋巴细胞，血管内皮等均不着色。分别观察MDA5在肿瘤内和周围基质两个区域的表达，其染色强度:不着色，0分;弱染色，1分;中等强度，2分;强染色，3分。染色细胞数(阳性率)占总肿瘤细胞百分比:0-5％，0分;6-25％，1分;26-50％，2分;51-75％，3分;75％以上，4分。因MDA5表达强度尚无统一标准，本研究进行强度及阳性率分层分析:染色强度为2-3分、阳性率为3-4分为高表达，染色强度0-1分、阳性率0-2分为低表达。
4.依据接收者操作特征曲线(Receiver operating characteristic，ROC)确定本队列158例口腔及口咽癌的NLR最佳临界值，曲线上数值符合最大约登指数(灵敏度/0.44+特异度/0.84-1)对应数值为最佳临界值，并进行分层分析。
5.统计学方法:采用SPSS21.0进行统计学分析，生存曲线及森林图使用GraphPadPrism7进行绘制。利用t检验分析CD15+中性粒细胞在三个区域的浸润深度差异，卡方检验分析MDA5瘤内和基质区表达差异;利用最佳临界值进行CD15+中性粒细胞浸润分层，Spearman相关系数分析CD15+中性粒细胞浸润及MDA5与临床病理指标的关系(rs范围为-1到+1)。Kaplan-Meier生存分析法(logrank检验)进行单因素生存分析，COX比例风险模型进行多因素分析。
研究结果
1.TCGA数据库分析:从TCGA数据库下载288例口腔癌患者数据建立队列研究，分析结果显示CD15与MDA5表达无显著相关性(rs=-0.020，P=0.729)。CD15的表达与原发肿瘤部位(CD15hi舌部比例最高，P=0.036)、组织学分级(CD15hi的患者组织学分级更高，分化更差，P=0.023)及是否行放化疗(CD15hi的患者更多的进行放化疗干预，P=0.033)显著相关，与年龄、性别、吸烟史、饮酒史、TNM分期及是否进行颈部淋巴结清扫无关。MDA5高表达者以女性患者比例更高(P＜0.001)，MDA5表达与其他临床指标均无关。单因素生存分析提示早期患者3年生存率较高(P=0.024)，CD15hi的患者3年生存率高于CD15low者(P=0.012)，MDA5与生存预后无显著相关。多因素分析提示年龄(P=0.025)、TNM分期(P＜0.001)、组织学分级(P=0.004)及是否行颈淋巴结清扫(P＜0.001)均与3年OS有关，CD15及MDA5不同表达3年OS无显著差异。
2.以下结果基于158例口腔及口咽癌患者队列进行分析:CD15+中性粒细胞在瘤内、交界及基质不同区域的浸润具有高度异质性。肿瘤基质中的CD15+中性粒细胞浸润最高(74/HPF，18-152/HPF)，在瘤内(37/HPF，7-84/HPF)及交界区(41/HPF，11-104/H PF)相对较低(P＜0.001)。
3.CD15+hi与临床病理学指标的关系:肿瘤内CD15+hi与TNM分期正相关(rs=0.179，P=0.025)，交界区CD15+hi在口腔癌中比例高于口咽癌(P=0.023);三个区域的CD15hi与年龄、性别、是否吸烟或饮酒、组织学分级、肿瘤大小及颈部淋巴结转移均无显著相关。
4.MDA5表达在肿瘤不同部位存在异质性:MDA5主要在肿瘤组织内高表达，基质内表达强度及阳性率均较低。瘤内MDA5强度高于肿瘤基质内(2-3分表达率，58.2％vs19.6％，P＜0.001)，瘤内MDA5阳性率高于肿瘤基质内(3-4分表达率，60.8％vs14.6％，P=0.005)。
5.MDA5表达与临床病理学指标关系:瘤内MDA5高表达与颈部淋巴结转移(rs=0.166，P=0.037)、TNM分期(rs=0.167，P=0.036)正相关，与组织学分化负相关(高分化比例48.8％vs30.6％，rs=-0.211，P=0.017)，与年龄、性别、是否吸烟或饮酒、肿瘤部位、组织学分级及肿瘤大小中均无显著相关。肿瘤基质中MDA5表达均与各临床病理学指标无显著相关。
6.生存分析:单因素生存分析提示基质内CD15+hi者OS(中位生存/月CD15+hivsCD15+low31.7vs46.3，P＜0.001)及RFS(中位生存/月CD15+hivsCD15+low31.0vs43.4，P=0.001)均较差，TNM分期较晚者RFS更差(中位生存/月Ⅲ-Ⅳ期vsⅠ-Ⅱ期32.6vs41.1P=0.039)，OS无显著差异;瘤内CD15+hi及交界区CD15+hi对OS及RFS无显著影响，其它临床病理学指标及瘤内、基质内MDA5表达均对OS及RFS无显著影响;多因素分析提示基质内CD15+hi是OS(HR=1.853，P＜0.001)及RFS(HR=1.664，P=0.003)的独立预后因素。
7.NLR与CD15+中性粒细胞相关性及其联合预后预测意义:NLRhi者与肿瘤内(P=0.081，rs=0.139)、交界(P=0.135，rs=0.119)及基质(P=0.520，rs=0.052)CD15+中性粒细胞浸润均无显著相关。NLRhi者OS(中位生存时间/月，33.1vs43.0，P=0.019)及RFS(中位生存时间/月，31.3vs41.2，P=0.019)均显著低于NLRlow者，联合NLR及基质CD15+中性粒细胞浸润进行生存分析提示NLRhi和/或基质CD15+hi患者的OS(中位生存时间/月，33.3vs51.7，P＜0.001)及RFS(中位生存时间/月，32.0vs48.8，P=0.001)均差，且联合生存分析P值更低，差异性更显著。
8.CD15+hi与MDA5表达无显著相关性:瘤内CD15+hi与瘤内MDA5强度(强度低vs强度高50.0％vs51.1％，rs=0.011P=0.894)及阳性率(阳性率高vs阳性率低53.2％vs49.0％，rs=-0.042P=0.603)均无显著差异;基质内CD15+hi与基质内MDA5强度(强度低vs强度高49.6％vs51.6％，rs=0.016P=0.842)及阳性率(阳性率低vs阳性率高48.1％vs60.9％，rs=0.090P=0.262)均无显著差异。
研究结论
1.对口腔及口咽癌此两种重要头颈癌进行肿瘤中不同部位CD15+中性粒细胞浸润特点的研究，发现CD15+中性粒细胞浸润有高度异质性，在肿瘤基质内浸润最高。癌巢区CD15+hi与TNM分期正相关，而基质内CD15+hi是OS及RFS的的独立预后因素，提示在此两种头颈癌的基质内CD15+中性粒细胞浸润具有预后影响意义。
2.首次对此两种头颈癌进行MDA5表达的观察研究，发现MDA5主要表达在的肿瘤组织内;瘤内MDA5表达与组织学分化、TNM分期和颈淋巴结转移相关，提示其在肿瘤进展过程中可能具有重要作用。
3.循环标志物NLRhi和/或局部基质CD15+hi者的OS及RFS均较差，且较单纯NLRhi生存差异更显著，提示联合检测局部中性粒细胞浸润及循环炎性标志物可能更好的预测预后，为精准预后预测提供依据。
4.首次进行此两种头颈癌肿瘤内及基质内CD15+中性粒细胞浸润与MDA5表达的相关性研究，发现两者无显著相关性，以期在进一步体外及动物模型实验中呈现出更多的结果并逐步转化为临床应用。