论文部分内容阅读
丙酮酸（pyruvic acid）是细胞代谢的关键中间产物,也是一种重要的有机酸,被广泛应用于食品工业、农业、医药工业等领域。近年来,发酵法生产丙酮酸受到国内外学者的密切关注。在众多已发现的丙酮酸生产菌株中,光滑球拟酵母（Candida glabrata）因具有高葡萄糖和酸耐受性,被认为是最具应用前景的丙酮酸生产菌株。然而,该菌株的丙酮酸发酵过程存在副产物形成机制不明确、胞内中心化合物调控复杂和溶氧依赖性强等问题影响了其大规模生产。本研究以C.glabrata CCTCC M202019为出发菌株,借助于生化工程和代谢工程策略,鉴定该酵母丙酮酸发酵过程中的主要副产物及其合成途径,并在此基础上提出代谢工程改造C.glabrata中心代谢网络的策略来强化丙酮酸合成及改善菌株对低氧环境的适应性。主要研究结果如下:（1）高通量筛选丙酮酸发酵过程差异明显的C.glabrata突变菌株为副产物鉴定提供基础。结合ARTP随机诱变和硝酸铁多孔板检测技术建立了一种高通量筛选丙酮酸发酵过程差异明显突变菌株的方法。进一步结合QPix 420全自动挑菌仪和全自动移液工作站等自动化仪器,提高了该方法的筛选通量和精度,使得整个高通量筛选过程更加高效。利用该方法从30000个突变子中经过几轮的高通量筛选,初筛获得了9株高产丙酮酸的突变菌株。通过摇瓶发酵复筛实验,最终获得了一株丙酮酸摇瓶产量提高32.3%的C.glabrata H6菌株和一株能使发酵液自发凝固的丙酮酸生产菌株C.glabrata 4-C10。这些丙酮酸发酵过程差异明显的突变菌株的获得为进一步鉴定C.glabrata丙酮酸发酵过程中的副产物提供基础。（2）鉴定C.glabrata发酵生产丙酮酸过程中的主要副产物及其代谢途径。通过对获得的C.glabrata 4-C10突变菌株和出发菌株的发酵液进行分离纯化,并结合酸水解、光谱分析及合成单体组分分析实验,鉴定了C.glabrata发酵生产丙酮酸过程中的主要副产物为多聚糖。对C.glabrata的副产物合成途径中相关基因进行转录水平分析,发现CAGL0H02695g和CAGL0K10626g基因是造成菌株胞外多聚糖积累的重要基因。在C.glabrata出发菌株中敲除这两个重要基因,使得菌株的副产物多聚糖积累降低了15.6%,而丙酮酸摇瓶产量提高了11.8%。实验结果也表明,虽然降低多聚糖合成会一定程度的改善丙酮酸胞外积累,但也会严重影响菌体生长。因此,完全阻断多聚糖合成来改善丙酮酸积累的策略似乎不可行。而调控与多聚糖合成密切相关的中心化合物来协调菌株生长与多聚糖合成似乎是进一步改善丙酮酸积累的高效策略。（3）调控C.glabrata发酵过程中丙酮酸亚细胞分布来强化丙酮酸的胞外积累。已有大量报道表明副产物多聚糖积累与胞内丙酮酸和ATP的亚细胞分布密切相关。借助载体工程策略研究丙酮酸的亚细胞分布对C.glabrata的中心碳代谢途径和丙酮酸胞外积累的影响,找到有利于丙酮酸胞外积累的最佳丙酮酸胞内分布趋势。强化丙酮酸进入线粒体的过程,改善了C.glabrata的中心碳代谢途径和丙酮酸胞外积累速率。在此过程中,发现和验证了不断积累的胞质丙酮酸趋势是影响C.glabrata中心碳代谢和丙酮酸胞外积累的关键因素。通过细胞膜定位表达线粒体丙酮酸载体蛋白调控丙酮酸向胞外转运,使C.glabrata中胞质丙酮酸分布趋势由上升趋势转变为下降趋势,达到了改善C.glabrata菌株的中心碳代谢途径和丙酮酸积累的目的,使得丙酮酸的积累量达到29.0g/L。同时,构建了一种结合sortase A介导连接和流式细胞检测技术的快速膜定位检测方法。（4）构建高效ATP无效循环系统缓解ATP对丙酮酸合成途径的反馈抑制。已有报道表明高胞内ATP水平不仅有利于菌株高效合成多聚糖等副产物,而且还会对糖酵解途径产生严重的反馈抑制,进而影响目标产物的合成。利用代谢工程策略构建了一种能高效降解C.glabrata胞内ATP的无效循环系统（ATP-FCS）,并进一步优化了该系统与中心代谢途径的关系改善了C.glabrata菌株的丙酮酸积累过程。通过对C.glabrata菌株生理特性的分析,将两种酶促反应过程（丙酮酸羧化酶（PYC2p）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PCK1p））引入C.glabrata的细胞质中,结合菌株本身的部分代谢途径构建ATP无效循环系统。对该系统进行评估,发现ATP-FCS能高效维持C.glabrata丙酮酸发酵过程中的胞内ATP和ROS处于较低水平,并有效改善了中心碳代谢流流向丙酮酸的效率,使得丙酮酸的胞外积累量提高了49.7%。另外,进一步优化ATP-FCS并协调ATP-FCS与其他代谢途径的关系,使得C.glabrata丙酮酸的最大摇瓶产量达到40.2 g/L。（5）设计低氧全局诱导因子缓解C.glabrata丙酮酸发酵过程对高溶氧的依赖性。高的胞外溶氧会加速菌株胞内丙酮酸进入TCA循环和氧化磷酸化途径,导致大量丙酮酸氧化分解成CO2,同时产生大量ATP。借助于代谢工程策略研究了低氧诱导因子（HIF-1）在低氧条件下对C.glabrata丙酮酸发酵过程的影响,改善C.glabrata低氧条件下的丙酮酸积累过程。通过文献挖掘和数据库分析手段,发现C.glabrata葡萄糖转运和糖酵解途径中的大部分酶基因启动子区域存在HIF-1因子特异性识别的A/GCGTC基序。通过引入HIF-1因子于C.glabrata中,改善了菌株在低氧条件下的葡萄糖转运和糖酵解途径中一些关键酶基因的转录水平,并使低氧条件下的丙酮酸产量提高了32.4%。进一步优化菌株的溶氧控制条件、敲除C.glabrata中的脯氨酸羟基化酶来改善HIF-1在菌株胞内的稳定性,使得丙酮酸在低氧条件下的积累效率得到了进一步提高。最后,维持菌株在发酵罐上的溶氧水平为10%,使得菌株的最大丙酮酸产量达53.1 g/L。