研究目的:本研究旨在探究提高T细胞线粒体功能对苯并[a]芘（Benzopyrene,Bap）诱导肺癌发生的影响,明确提高T细胞线粒体功能的药物丙戊酸（valproic acid,VPA）与辅酶Q10(Coenzyme Q10,Co Q10)联合使用对Bap诱导的小鼠肺癌的改善作用,并探究其作用机制。研究内容和研究方法:1.筛选提高T细胞线粒体功能药物根据文献及前期预实验结果本部分实验所使用干预药物选择僵蚕（Bombyx Batryticatus,BB,5 g/kg）,生半夏（Raw pinellia,RP,5 g/kg）以及VPA与Co Q10联合用药(CM,150 mg/kg VPA+100 mg/kg Co Q10)三种干预方式。以Balb/C小鼠为研究对象,按照实验设计随机分组,分为对照组（灌胃橄榄油）,模型组（灌胃苯）和干预组（灌胃苯和药物）,每周灌胃5天,连续灌胃4周。通过对小鼠外周血T细胞线粒体功能测定,对脾脏,胸腺进行病理检测,对机体免疫功能及抗氧化功能进行评价从而明确不同药物对小鼠免疫功能的影响并筛选出能有效提高T细胞线粒体功能的药物。2.CM对Bap诱导的肺癌发生率的影响体外实验中,以原代小鼠T细胞为研究对象,观察Bap对T细胞线粒体功能的影响,以及使用药物干预是否能够有效预防Bap造成的T细胞线粒体损伤。使用细胞共培养技术,观察T细胞线粒体功能改变对其肿瘤杀伤功能的影响。以雄性昆明小鼠为观察对象,按照实验设计随机分组,分别为对照组,Bap组,Bap+VPA组,Bap+Co Q10组,Bap+CM组。Bap每周灌胃一次,共灌胃8周,干预组从实验开始每日灌胃给药,连续给药22周。实验结束后分别观察不同药物对小鼠肺癌发病率的影响,测定不同药物对小鼠抗氧化能力,免疫因子水平,肺部免疫微环境,外周、胸腺、脾脏T细胞线粒体功能的影响,明确VPA,Co Q10及其联合用药对Bap诱导小鼠T细胞线粒体功能及肺癌的影响。3.药物预防Bap诱导肺癌发生的机制探究利用蛋白质组学技术,测定对照组,模型组及CM干预组T细胞蛋白质表达水平,利用生物信息学分析方法,对发生显著改变的蛋白进行富集分析,通过对照组与Bap组的比较,获得Bap诱导肿瘤的信号通路,进一步通过Bap组与CM组的比较,获得CM预防小鼠肺癌发生可能的信号通路,并对所获得差异蛋白进行比较分析,获得与肺癌发生密切相关的关键蛋白。利用免疫组化对所筛选出的蛋白表达量进行验证,确定其在小鼠肺癌发生过程中的作用。根据蛋白质组学结果,筛选出可能影响T细胞线粒体功能调控蛋白,以T淋巴细胞为研究对象,通过使用慢病毒调节目的蛋白表达水平,获得蛋白低表达的T细胞以及过表达的T细胞。通过测定其对线粒体功能影响,判断所筛选出蛋白的作用。研究结果:1.CM能显著提高T细胞线粒体功能苯干预后小鼠血浆、胸腺组织及脾脏组织氧化物丙二醛（Malondialdehyde,MDA）水平升高,抗氧化物质超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）水平降低。苯诱导了小鼠机体氧化应激反应的发生,同时伴随着脾脏、胸腺组织结构损伤,T细胞比例失衡以及免疫细胞线粒体功能损伤,引起活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平显著升高,三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）水平显著降低,导致免疫损伤出现。在使用BB,RP,CM干预后,与苯暴露组相比,MDA水平显著降低,SOD、GSH-Px水平显著升高、组织结构损伤减轻,T细胞比例恢复,同时三种药物均可预防苯导致的T细胞ROS表达水平的升高,并提高外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）ATP水平,保护T细胞线粒体功能。其中CM对T细胞线粒体功能的改善效果最为显著。2.CM降低Bap诱导的小鼠肺癌发生率体外实验中发现,Bap暴露导致T细胞线粒体功能呈剂量依赖性降低,主要表现为Bap暴露后T细胞ROS表达水平显著升高,ATP水平显著下降,同时T细胞活性显著降低。T细胞与肿瘤细胞共培养发现,Bap显著降低T细胞的肿瘤杀伤能力,主要表现为促进肿瘤细胞的迁移和减少肿瘤细胞死亡。在Bap暴露的情况下,采用CM干预T细胞,可预防Bap诱导的T细胞线粒体损伤,提高T细胞存活率,同时显著升高T细胞的肿瘤杀伤功能。体内实验结果表明与对照组（16.7%）相比,Bap显著提高小鼠肺癌发生率（71.4%）,导致肺部CD4+/CD8+T细胞比例显著升高。同时Bap暴露提高MDA表达水平,降低SOD,GSH表达水平,导致PBMC、脾脏、胸腺T细胞ROS水平升高,ATP水平降低,伴随着PBMC及胸腺中T细胞比例失衡。与Bap组相比,使用VPA（47.6%）,Co Q10（45.5%）,CM（40.0%）可显著降低小鼠肺癌的发生率,且CM组降低效果最为显著。CM干预降低肺组织中CD4+/CD8+T细胞比值,提高抗氧化物SOD、GSH水平,降低氧化物MDA水平,降低PBMC、胸腺T细胞ROS表达,提高ATP表达水平。其中,CM对胸腺T细胞线粒体功能的改善作用最为显著。3.Bap与CM调节细胞氧化磷酸化信号通路影响肺癌发生与对照组相比,Bap诱导肺癌小鼠胸腺T细胞中有281个蛋白上调,327个蛋白下调。所有差异蛋白京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集后可发现Bap诱导了肺癌小鼠细胞凋亡,细胞周期,抗原加工提呈等信号通路相关蛋白表达水平的变化。且胸腺细胞细胞凋亡水平结果显示Bap诱导组小鼠胸腺细胞凋亡比例较对照组显著升高,CM干预后,胸腺细胞凋亡细胞占比有所降低。上调蛋白基因本体论（Gene Ontology,GO）富集分析发现Bap暴露后线粒体功能执行相关过程,如线粒体蛋白复合物,TCR信号小体,免疫受体分化,抗原表达提呈,NADP代谢过程等发生显著上调。同时下调蛋白GO富集结果显示线粒体蛋白复合物,NAD代谢过程,NADH代谢等线粒体生物学代谢过程发生改变。KEGG信号通路分析结果显示Bap暴露后T细胞氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation,OXPHOS）信号通路显著下调,此外,结合Bap诱导组及CM干预组的差异蛋白分析显示线粒体蛋白复合物相关蛋白ATP5MF及SDHD可能在Bap诱导的肺癌发生及CM预防肺癌发生中发挥关键作用。随后,采用免疫组化对线粒体蛋白复合物亚基SDHD及ATP5MF进行验证,与对照组相比,Bap暴露提高ATP5MF表达水平,降低SDHD表达水平,与Bap组相比,CM降低ATP5MF,提高SDHD表达水平。结果表明ATP5MF与蛋白质组学所测定表达趋势相一致。4.ATP5MF表达水平改变影响T细胞线粒体功能为了进一步阐明ATP5MF对T细胞线粒体功能的影响,采用过表达ATP5MF慢病毒载体提高T细胞中ATP5MF的表达水平,结果显示,在Bap诱导T细胞损伤模型中,过表达ATP5MF显著改善Bap诱导的T细胞ROS水平升高及ATP含量水平的下降。同时,与Ba P组相比,过表达ATP5MF显著提高线粒体生物发生相关蛋白PGC-1α及TFAM表达,以上结果表明过表达ATP5MF显著改善Bap诱导的T细胞线粒体功能下降。采用低表达ATP5MF慢病毒载体降低T细胞中ATP5MF的表达水平,结果显示,ATP5MF表达水平降低导致T细胞ROS表达水平升高,PGC-1α及TFAM表达水平显著降低。而与ATP5MF低表达组相比,使用CM可提高细胞ATP5MF表达水平,降低T细胞ROS表达水平,提高T细胞ATP表达水平,同时提高PGC-1α及TFAM蛋白表达水平。研究结论:1.CM可显著改善苯导致小鼠免疫损伤及T细胞线粒体功能损伤。2.CM在体外可预防Bap导致的线粒体损伤,并提高T细胞肿瘤杀伤功能。3.CM在小鼠体内可降低Bap诱导的肺癌发生率。4.Bap诱导的小鼠肺癌与T细胞氧化磷酸化过程受损相关。5.Bap下调ATP5MF导致线粒体功能损伤,CM可上调ATP5MF逆转Bap导致的线粒体功能损伤。