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磷（P）是植物生长发育必需的一种大量营养元素,是核酸、磷脂、辅酶和ATP等重要化合物的构成成分。为适应外界多变的Pi环境,植物体进化出了一套精细的Pi稳态调控机制。含有SPX结构域的蛋白在植物Pi稳态调控中具有重要作用,拟南芥中含有SPX结构域的蛋白有4个家族:SPX-MFS、SPX-EXS、SPX-RING和SPX。本实验室前期研究揭示了 SPX-MFS家族一个定位于液泡膜上的Pi转运体SPX-MFS1（VPT1）的功能,该转运体调控了 Pi从细胞质往液泡中的转运,对于拟南芥的Pi稳态至关重要。SPX-EXS家族被预测为Pi转运家族,其代表成员PHO1被证实具有调控Pi从地下部往地上部转运的功能,我们推测其他成员也可能具有Pi转运功能,因此我们根据该家族进化关系,选择位于进化树不同簇上的PHO1;H4、PHO1;H5和PHO1;H9三个基因的突变体进行了表型筛选,并利用遗传学方法、分子生物学方法以及组织化学染色等实验技术着重对PHO1;H4的Pi转运功能进行了探究。主要研究结果如下:（1）PHO1;H4对Pi等胁迫筛选条件不敏感首先,我们对突变体pho1;h4、pho1;h5和pho1;h9进行了鉴定,并通过杂交构建了双突变体pho1;h4/h5、pho1;h4/h9和pho1;h5/h9及三突变体pho1;h4/h5/h9。通过PCR及RT-PCR鉴定,突变体均为基因完全敲除的纯合突变体。随后我们对突变体进行了表型筛选,结果显示突变体对不同浓度的Pi、Pi与二价阳离子组合筛选条件、盐胁迫及渗透胁迫均不敏感,突变体与野生型（Col-0）在根长、鲜重及生长状况方面均无显著性差异。（2）PHO1;H4主要在叶片及根的维管组织表达为了获得研究对象更多的信息,为下一步研究提供帮助,我们对转基因植株进行了组织化学染色（GUS）,获得了 PHO1;H4、PHO1;H5、PHO1;H9的组织定位。结果显示,PHO1;H4在幼苗（3～4d）的须根、小苗（6～21d）叶片、根的维管柱中均有表达;PHO1;H5与PHO1;H4的组织定位模式较为相似,同样在幼苗（3～4d）须根及小苗（5～18d）叶片、根的维管柱中存在;PHO1;H9在幼苗中没有表达,在小苗（5～7d）的排水器有表达,在2-3周的小苗叶片、叶柄以及根中均有少量表达。（3）PHO1;H4限制Pi从地下部往地上部的转运我们对突变体的Pi含量进行测定,发现在40μM、130μM及500μM Pi处理下,pho1;h4突变体的地上部（shoot）Pi含量均比野生型高20%左右,而地下部（root）Pi含量与野生型无显著性差异,表明PHO1;H4起到限制Pi从地下部往地上部长距离转运的作用。随后我们杂交构建双突并对pho1;h4/h5、pho1;h4/h9的Pi含量进行测定,结果表明两个双突地上部Pi含量比野生型略高,但是比pho1;h4突变体低,表明在PHO1;H4突变的背景下,PHO1;H5、PHO1;H9突变造成了地上部Pi含量的降低。（4）PHO1;H4突变影响拟南芥不同组织中Pi的分配为探究PHO1;H4在Pi分配中发挥的功能,我们测定了pho1;h4突变体与野生型成苗中各组织器官的Pi含量。结果显示:1.3μM Pi处理后,pho1;h4突变体花中的Pi含量高于野生型,其他组织器官差异不显著;130μM Pi处理后,pho1;h4突变体果荚、花、莲座叶和茎生叶中的Pi含量均高于野生型;1.3mM Pi处理后,ph1;h4突变体果荚、花、莲座叶、茎生叶和茎中的Pi含量均高于野生型。此外,PHO1;H4多在花、果荚等生长旺盛的组织器官表达,符合Pi再分配时靶向生长旺盛器官的规律,且在不同浓度Pi处理后,PHO1;H4的表达位置存在微弱变化。上述结果表明PHO1;H4突变影响拟南芥不同组织中的Pi分配。（5）PHO1;H4发挥作用需要PHO1为探究PHO1与PHO1;H4的功能关联,我们首先通过qPCR分析,发现在低Pi条件下,地上部中的PHO1和PHO1;H4均上调表达。随后我们构建了pho1/pho1;h4双突,并进行了与pho1和pho1;h4 Pi含量的比较,结果显示pho1与pho1/pho1;h4突变体地上部Pi含量均显著低于野生型及pho1;h4,但pho1与pho1/pho1;h4 Pi含量无显著性差异,表明PHO1;H4发挥限制Pi从地下部往地上部转运的功能需要PHO1的参与,或者可能需要PHO1提供的高Pi环境。（6）PHO1;H4突变影响Pi稳态调控网络PHR1-miR399-PHO2是拟南芥响应Pi胁迫重要的一条信号通路,为了探究PHO1;H4突变是否对该通路产生影响,以及是否影响其他Pi稳态调控基因的表达,我们用不同浓度Pi处理pho1;h4突变体及野生型幼苗后,通过q-PCR测定PHR1、miR399、PHO2以及在拟南芥Pi稳态中发挥作用的基因（AT4、VPT1、ZIP5、NLA、PHT1;4、PHT1;1、IPS、miR399A、miR399B、RNS1）的表达。结果显示,PHO1;H4突变后,10μM Pi处理下,PHT1;1基因表达量上调至4倍左右,RNS1表达量下调至0.38倍;1.3mM Pi处理下,AT4、PHO2、PHT1;1、IPS、miR399B基因分别上调至5.1倍,2倍,4.8倍,3.3倍和2.3倍,RNS1表达量下调至0.13倍。表明PHO1;H4的突变对PHR1-miR399-PHO2信号通路有影响,在高Pi条件下上调了 PHO2和miR399的表达,并且PHO1;H4的突变对拟南芥Pi的调控网络产生扰动。综上所述,本论文鉴定出一个限制Pi长距离运输的蛋白PHO1;H4,PHO1;H4基因突变之后拟南芥地上部Pi含量比野生型高20%左右,不同组织间Pi的分配也受到影响,且PHO1;H4功能的发挥需要PHO1。本论文对PHO1;H4 Pi转运功能的初步研究,为培育磷素高效利用作物提供了理论基础和实践依据。