【目的】TPD52基因定位于8q.21.13染色体区。既往研究发现其编码蛋白TPD52在乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤中的表达均异常增加,并与肿瘤的发生、发展密切相关。但TPD52在胶质瘤中表达情况及其调控机制尚未见报道,TPD52的生物学功能及其表达异常在胶质瘤发生、发展中的作用尚不清楚。作为一种表观遗传学调控机制,miRNA通过基因沉默在转录后水平调控基因表达。已有研究显示,miRNA表达和结构异常是导致肿瘤细胞蛋白表达异常的重要原因。但目前在胶质瘤细胞调控TPD52表达的miRNA仍未确定,miRNA调控紊乱是否是导致胶质瘤细胞TPD52表达异常的分子机制尚有待探索。本研究的目的在于:(1)检测胶质瘤中TPD52的表达情况,分析其表达水平与胶质瘤良恶性级别及患者预后的关系;(2)通过体内外实验观察TPD52对胶质瘤增殖与侵袭的影响,并探索其分子机制;(3)通过生物信息学预测和CGGA数据库分析筛选在胶质瘤细胞中与TPD52表达密切相关的候选miRNA,并通过荧光素酶实验证实候选miRNA对TPD52表达的调控作用;(4)检测调控TPD52表达的miRNA在胶质瘤中的表达水平,分析其与胶质瘤TPD52表达水平、肿瘤良恶性级别及患者预后的关系;(5)观察纠正该miRNA表达异常对胶质瘤细胞TPD52表达水平以及肿瘤细胞增殖与侵袭的影响;(6)通过通路研究进一步探索胶质瘤细胞中TPD52表达的调控机制。【方法】1.采用组织微阵列与免疫组织化学技术检测非肿瘤对照脑组织及不同级别胶质瘤组织中TPD52与Ki-67的表达水平,分析其在不同级别胶质瘤中的表达变化;利用Pearson法分析TPD52表达水平与Ki-67指数之间的相关关系;结合临床随访资料,通过Kaplan-Meiers生存分析法分析TPD52的表达水平与患者总生存期和无症状生存期的关系;建立Cox比例风险回归模型,筛选胶质瘤患者预后的独立预测因子。2.利用重组慢病毒感染构建稳定敲低TPD52的人胶质母细胞瘤细胞U251及LN229的亚细胞系(U251/LN229-sh-TPD52#1、U251/LN229-sh-TPD52#2)和对照亚细胞系(U251/LN229-sh-NC),利用Western blot验证敲低效率。3.采用EdU细胞增殖实验、MTS及流式细胞术细胞周期检测实验检测敲低TPD52的表达水平能否有效抑制胶质瘤细胞的增殖活性及影响胶质瘤细胞的周期分布。利用Transwell细胞侵袭实验检测TPD52对胶质瘤细胞侵袭能力的影响,F-actin荧光染色实验观察TPD52对胶质瘤细胞中F-actin分布的影响。4.利用LN229各稳定亚细胞系(LN229-sh-NC、sh-TPD52#1、sh-TPD52#2)建立裸鼠颅内原位移植瘤模型,观察并记录各组小鼠的体重和生存期,利用生物发光活体成像技术每2周监测一次移植瘤的大小。移植瘤取出后,用HE染色观察肿瘤的大小及侵袭情况;用免疫组织化学染色检测肿瘤中TPD52和Ki-67的表达水平。5.利用磷酸化蛋白质组学筛选与TPD52促进胶质瘤细胞增殖与侵袭密切相关的信号通路,并通过Western blot进一步验证效应通路与分子机制。6.利用生物信息学预测结果筛选调控TPD52表达的miRNAs,并结合CGGA数据库中与TPD52表达呈显著负相关的miRNAs,最终筛查出在胶质瘤中调控TPD52表达的miRNA(miR-449b)。并利用双荧光素酶实验进一步验证在胶质瘤中TPD52是否为miR-449b的靶基因。7.采用组织微阵列与锁定寡核苷酸探针原位杂交技术检测同批对照脑组织与胶质瘤组织中miR-449b的表达水平,分析其在不同级别胶质瘤中的表达变化;利用Pearson法分析miR-449b与TPD52表达水平之间以及其与Ki-67指数之间的相关关系;结合临床随访资料,通过Kaplan-Meiers生存分析法分析miR-449b的表达水平与患者总生存期和无症状生存期的关系;建立Cox比例风险回归模型,判断miR-449b是否为胶质瘤患者预后的预测因子。8.利用EdU细胞增殖实验和MTS检测miR-449b对胶质瘤细胞增殖活性的影响,Transwell细胞侵袭实验检测miR-449b对胶质瘤细胞侵袭能力的影响,F-actin荧光染色实验观察miR-449b对胶质瘤细胞中F-actin分布的影响。补充外源性TPD52,观察其能否逆转miR-449b对胶质瘤细胞增殖、侵袭及F-actin分布的影响。9.利用qRT-PCR检测敲低TPD52和抑制ERK活性后miR-449b的表达变化,采用染色质免疫共沉淀(ChIP-PCR)进一步探索导致该变化的分子机制。【结果】1.免疫组化结果显示,胶质瘤组织中TPD52的表达水平普遍异常升高,其阳性标记指数(LI%)随肿瘤良恶性级别的升高而升高,各组间差异均有统计学意义(P<0.05~0.001);Pearson相关分析显示,TPD52 LI%与Ki-67 LI%呈显著正相关(r=0.799;P<0.0001);Kaplan-Meiers生存分析显示,在胶质瘤患者中TPD52高表达患者的无症状生存期及总生存期均明显低于TPD52低表达的患者(P<0.0001);Cox比例风险回归分析显示TPD52是胶质瘤患者预后的危险因子,且TPD52 LI%可作为胶质瘤患者预后的独立预测因子。2.EdU及MTS实验结果显示,U251和LN229 sh-TPD52#1和sh-TPD52#2亚细胞系的细胞增殖活性明显低于相应sh-NC亚细胞系(P<0.05~0.001)。FCM细胞周期检测结果显示,与相应sh-NC亚细胞系相比U251和LN229 sh-TPD52#1和sh-TPD52#2亚细胞系的G0/G1期细胞百分比显著升高(P<0.001)。Transwell细胞侵袭实验结果显示,与sh-NC亚细胞系相比,sh-TPD52#1和sh-TPD52#2亚细胞系细胞侵袭能力显著降低(P<0.001)。F-actin荧光染色实验结果显示,U251和LN229 sh-TPD52#1和sh-TPD52#2亚细胞系的F-actin散在分布于细胞内,而相应sh-NC亚细胞系中F-actin呈局部聚集。3.裸鼠移植瘤实验结果显示,sh-TPD52#1和sh-TPD52#2组裸鼠移植瘤生长速度和体重下降速度均明显低于sh-NC组,且sh-TPD52#1和sh-TPD52#2组裸鼠生存率高于sh-NC组。HE染色结果显示,sh-TPD52#1和sh-TPD52#2组移植瘤的大小和侵袭性明显低于sh-NC组。免疫组织化学染色检测结果显示,sh-TPD52#1和sh-TPD52#2组移植瘤的TPD52和Ki-67阳性标记指数均明显低于sh-NC组。4.磷酸化蛋白质组学检测功能富集分析显示,在胶质瘤细胞中TPD52主要参与细胞分化、细胞周期、细胞周期调控、细胞骨架形成、微管细胞骨架形成、肌动蛋白细胞骨架形成等相关信号通路调控。激酶分析显示,TPD52调控上述功能主要与ERK和GSK两个激酶有关。Western blot验证结果显示,敲低TPD52可以有效抑制胶质瘤细胞中cyclin D1和c-Myc的表达水平,抑制GSK-3β、Erk1/2、MSK1、RSK1、LIMK1/2和Cofilin的磷酸化水平,增加β-catenin的磷酸化水平。5.生物信息学预测结果显示,种子序列可与TPD52 mRNA 3’-UTR区特异性结合的miRNA共有8个;CGGA数据库筛查结果显示,与TPD52表达呈显著负相关(p<0.001)的miRNA共有98个。综合上述预测和筛选结果,miR-449b是胶质瘤细胞中调控TPD52表达的候选miRNA。TPD52 mRNA 3’-UTR存在两个可与miR-449b种子序列互补的靶序列。荧光素酶实验结果显示,在U251及LN229细胞系,野生型TPD52 mRNA 3’-UTR(TPD52-3’-UTR-WT1和TPD52-3’-UTR-WT2)可通过与miR-449b结合沉默上游荧光素酶报告基因的表达,而删除靶序列的突变型3’-UTR(TPD52-3’-UTR-MT1和TPD52-3’-UTR-MT2)则不能介导该沉默效应。6.原位杂交结果显示,miR-449b在各级别胶质瘤中的表达水平均低于非肿瘤对照脑组织,并随胶质瘤良恶性级别的升高而降低,各组间差异均具有统计学意义(P<0.001);Pearson相关分析显示,miR-449b LI%与Ki-67 LI%(r=-0.692;P<0.0001)和TPD52 LI%(r=-0.660;P<0.0001)均呈负相关;Kaplan-Meiers生存分析显示,在胶质瘤患者中miR-449b高表达组的无症状生存期和总生存期均高于miR-449b低表达组,差异有统计学意义(P<0.0001);Cox比例风险回归分析显示miR-449b是胶质瘤患者预后的保护因子,且miR-449b LI%可作为胶质瘤患者无症状生存期和总生存期的独立预测因子。7.EdU、MTS及Transwell细胞侵袭实验结果显示,在U251和LN229miR-449b亚细胞系的细胞增殖活性、侵袭能力均明显低于相应Con亚细胞系(P<0.01~0.001),而通过真核表达质粒转染提高细胞内TPD52表达水平可有效逆转miR-449b的增殖与侵袭抑制效应(P<0.05~0.001)。免疫荧光实验结果显示,miR-449b可显著降低U251与LN229细胞浆中TPD52的含量。F-actin荧光染色实验结果显示,在Con和miR-449b+TPD52组中F-actin局部聚集于细胞突起部位及细胞膜内侧,荧光信号较强;在miR-449b组中F-actin散在分布于胶质瘤细胞内,且荧光强度明显降低,蛋白骨架紊乱。8.数据库分析显示,miR-449b基因转录起始位点附近有组蛋白3的第27位赖氨酸的三甲基化(H3K27·)的富集,且qRT-PCR检测结果也显示,敲低TPD52和抑制ERK通路均可增加miR-449b的表达水平(P<0.05~0.001)。染色质免疫共沉淀实验结果显示,与DMSO对照组相比,ERK抑制剂组中与miR-449b基因转录起始位点相结合的H3K27me3显著减少(P<0.01~0.001)。【结论】1.胶质瘤中普遍存在TPD52表达水平异常增高,且与肿瘤良恶性级别呈正相关,与患者的无症状生存期及总生存期呈负相关,TPD52 LI%可作为辅助胶质瘤良恶性分级的参考指标和评价患者预后的独立预测因子。2.TPD52是胶质瘤的促瘤因子,其表达异常增高可能是导致胶质瘤发生、发展的重要因素。敲低TPD52可明显抑制胶质瘤的增殖与侵袭能力,TPD52可作为恶性胶质瘤基因干预和分子靶向治疗的有效靶点。3.在胶质瘤细胞中TPD52可通过激活ERK与GSK通路而促进胶质瘤的增殖活性与侵袭能力。4.在胶质瘤细胞中TPD52是miR-449b的天然靶基因,miR-449b可通过对转录后水平的调控降低TPD52蛋白的表达水平。5.胶质瘤中普遍存在miR-449b表达水平异常降低,其表达水平与胶质瘤恶性级别呈负相关,与胶质瘤患者的无症状生存期及总生存期呈正相关,miR-449b LI%可作为辅助胶质瘤良恶性分级的参考指标和患者预后的独立预测因子。6.miR-449b是胶质瘤的抑瘤miRNA,其表达异常降低可能与胶质瘤发生发展有密切关系。补充外源性miR-449b可以有效抑制胶质瘤细胞的增殖与侵袭能力,瞬时提高TPD52的表达水平可以有效的部分逆转miR-449b的抑制效应。提示miR-449b表达的降低可能是胶质瘤中TPD52过表达的原因之一。7.在恶性胶质瘤细胞中TPD52可通过激活ERK、GSK信号通路而促进细胞周期进程、增殖及侵袭能力。此外,TPD52可通过激活ERK信号通路促进H3K27me3的形成,使其在miR-449b转录起始位点富集增加,从而抑制miR-449b的转录水平,解除miR-449b对TPD52的靶向抑制效应,因此胶质瘤细胞中存在TPD52/ERK/H3K27me3/miR-449b异常反馈调控环路。在恶性胶质瘤中,该环路异常激活通过信号放大机制进一步抑制miR-449b表达并进一步促进TPD52过表达,而过表达的TPD52通过激活ERK/GSK信号通路促进胶质瘤细胞无限增殖和侵袭,以此在胶质瘤的发生及恶性进展过程中发挥促瘤作用。