目的:系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种多系统受累的慢性自身免疫性疾病。临床表现多种多样,累及肾脏出现蛋白尿,血尿乃至肾衰竭;心血管系统受累则常出现心包炎,心内膜炎及冠状动脉损害。当SLE患者出现无菌性脑炎,脑血管病变,头痛,急性意识错乱,认知功能减退,情绪障碍及精神病等中枢神经系统(central nervous system,CNS)受累症状时,称之为神经精神性狼疮,即狼疮脑病(neuropsychiatric SLE,NPSLE)。目前有关NPSLE的病理机制仍不清楚。已有临床研究发现抗核糖体P蛋白自身抗体(autoantibodies against ribosomal P protein,Anti-P)等来自SLE患者血清中的自身抗体与NPSLE的神经精神症状密切相关。在动物实验中发现这些自身抗体可攻击大脑海马区神经元从而造成空间记忆功能的损害。然而既往有关NPSLE研究大多只检验了自身抗体对大脑神经元的直接作用,而在CNS中发挥免疫和神经调节作用的小胶质细胞却很少受到关注。目前已有越来越多的证据表明,小胶质细胞介导的神经炎症反应在多种神经精神疾病中都起着重要作用。为了深入探讨小胶质细胞与NPSLE的相关性,我们在本研究中以正常小鼠为模型开展一系列在体实验,检验SLE患者来源的Anti-P IgG(immunoglobulin G,IgG)等致病因素对脑组织细胞形态,神经电生理活动和认知行为功能的影响,着重探讨小胶质细胞介导的炎症反应的发生发展过程,并验证通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)的途径能否缓解神经炎症反应,从而达到治疗Anti-P IgG诱导的神经功能障碍的目的。研究方法:1、收集SLE患者血清或健康对照者血清,通过在体脑内微量注射的方法,将其注射到小鼠侧脑室内(intracerebroventricular,ICV),通过在体荧光显微成像的方法观察脑微血管内白细胞贴壁滚动和粘附情况,以评价微血管内炎症反应的程度。2、通过注射含有热灭活H37Ra结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂(complete Freund’s Adjuvant,CFA)和百日咳毒素(pertussis toxin,PTx)的方法提高小鼠脑血屏障(blood brain barrier,BBB)的通透性,然后经尾静脉注射SLE患者来源的Anti-P IgG(immunoglobulin G),使其能够通过BBB进入到CNS中。3、在小鼠大脑初级听皮层(the primary auditory cortex,A1)植入电极,记录A1对40 Hz click-train刺激反应的脑电图(electroencephalogram,EEG)信号,以评价听觉稳态反应(auditory steady-state response,ASSR)。4、制作脑组织切片,使用神经元特异性核蛋白(neuron-specific nuclear protein,NeuN)、离子钙接头蛋白(ionized calcium binding adapter molecule,Iba-1)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)分别对神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞进行特异性免疫荧光染色,以评价不同类型细胞的密度和形态的变化。通过TUNEL法来检测脑组织中神经细胞的凋亡情况。检测趋化因子[chemokine(C-C motif)ligand 2,CCL2和CCL5]和粘附分子[P-选择素(P-Selectin)和细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule,ICAM-1)]表达情况。5、使用集落刺激因子-1受体(colony-stimulating factor-1 receptor,CSF1R)抑制剂PLX3397选择性消除小鼠脑内小胶质细胞,观察在没有小胶质细胞存在的情况下Anti-P IgG对小鼠脑神经活动的影响。6、将亲和纯化的Anti-P IgG或健康对照IgG注射到正常小鼠左右腹侧海马CA1区。48 h后,通过社交行为实验来评价Anti-P Ig G对小鼠社会认知记忆功能的影响。并通过嗅觉测试和旷场试验来评价小鼠嗅觉功能和运动能力。7、用qRT-PCR方法检测脑组织中细胞因子[肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-1(interleukin,IL-1)和IL-6,干扰素-γ(interferon,IFN-γ)],趋化因子(CCL2和CCL5)和神经营养因子(IL-4和IL-10)的表达水平。8、检验预先使用米诺环素和雷帕霉素(rapamycin,Rapa)预处理小鼠能否减轻上述组织学,电生理和行为学检测的异常表现。结果:1、我们利用活体显微成像的方法观察到:ICV注射SLE血清后导致小鼠脑微血管中出现白细胞贴壁滚动和粘附现象。免疫组织切片染色结果显示SLE血清可以使小鼠大脑皮层和海马的Iba-1染色的小胶质细胞密度增加,并呈现激活状态。同时脑组织中炎性介质、趋化因子和粘附分子表达水平显著升高。应用米诺环素治疗后白细胞的贴壁滚动和粘附现象也有所减轻,并且脑组织中小胶质细胞活化明显减少,炎症分子水平降低。2、注射到外周循环血中的Anti-P IgG可以通过打开的BBB进入脑内,促使ASSR增强的同时激活脑组织中的小胶质细胞,但未造成明显的神经细胞凋亡。当脑内小胶质细胞被消除时,Anti-P IgG可导致ASSR严重降低并同时出现明显的神经细胞凋亡。3、在腹侧海马CA1区内注射Anti-P IgG可以造成小鼠的社会认知能力损害,而嗅觉和运动功能并未受到影响。同时伴有vCA1区内神经元损伤、星形胶质细胞和小胶质细胞激活,白细胞介素(IL-1β、IL-6)和TNF-α等炎症因子的产生增加,而IL-4和IL-10的产生减少。预先应用Rapa治疗可以缓解Anti-P Ig G引起的社会认知功能障碍,减少神经病变及星形胶质细胞和小胶质细胞的活化,同时还减少了促炎细胞因子的产生并且增加了抗炎细胞因子的产生。结论:1、我们的研究提示SLE患者血清来源的致病因素可以引起小胶质细胞活化,以及白细胞与脑微血管粘附等炎症反应,这可能是造成SLE患者BBB功能受损,外周循环中的自身抗体大量进入CNS的一个重要原因。2、SLE患者来源的Anti-P IgG可引起ASSR等脑神经电活动出现异常,而在小胶质细胞存在的情况下这种异常电活动可以恢复,但是如果失去了小胶质细胞的保护则会出现不可逆的神经损伤。3、小胶质细胞介导的神经炎症反应可能参与了Anti-P Ig G诱导的社会认知行为障碍,Rapa可以通过抑制神经炎症反应而发挥对神经功能的保护作用。