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一 研究背景及目的骨髓增生异常综合征（MDS）是一种异质性造血系统疾病,以骨髓无效造血、病态造血和高风险向急性髓系白血病（AML）转变为特征。因其具有高度异质性,生存期可在数月至数年之间变化。准确地预测MDS患者的预后对指导治疗有着十分重要的临床意义。尽管包含原始细胞的比例、血细胞减少的程度和细胞遗传学作为参数的修订版国际预后评分系统（IPSS-R）在临床上应用广泛,但遗憾的是,仍有部分患者的临床结局与风险评估不符。这提示我们需要探索一些新的与MDS患者预后密切相关的生物学特性来完善MDS预后评分系统。因此,本研究聚焦在基因突变、免疫失调及骨髓纤维化（MF）这三个方面,探讨其与MDS患者预后的关系。二 方法1.本研究第一部分回顾性分析2012年10月至2019年06月份我院血液科所有MDS住院患者临床资料。此研究的纳入标准包括:1)年龄≥14岁;2)具备初诊时骨髓标本的基因二代测序结果;3)具备完整的IPSS-R评分的参数。排除标准为初次骨穿即诊断为AML（MDS转化）。细胞遗传学分析采用常规染色体显带技术和荧光原位杂交方法。基因突变的检测方法为二代测序。通过分析患者基因突变的概况、基因突变与染色体核型的关系以及基因突变对疗效评估、白血病转化及总生存（OS）的影响,从而探讨基因突变在MDS预后评估的意义;本研究还将患者分为细胞遗传学正常组和异常组进行亚组分析,从而了解两组间基因突变的意义是否存在差异。2.第二部分通过对2017年04月至2020年11月份在我院血液科标本库冻存的MDS患者初诊时骨髓标本和健康供者骨髓标本进行磁珠分选,分选出CD34+细胞并提取RNA。符合测序要求的标本共45例,其中MDS患者42例,健康供者3例,然后通过二代测序方法进行转录组测序。采用DESeq2软件分析MDS患者和健康对照组、相对低危组和相对高危组MDS患者mRNA的差异表达。采用基因本体论（GO）、京都基因百科全书（KEGG）、疾病本体论（DO）进行功能富集分析。通过Cox和LASSO-Cox回归选取与预后相关的免疫相关基因,建立一个线性预后模型。作出依赖时间的受试者工作特征（ROC）曲线,并使用生存ROC软件包计算曲线下面积（AUC）和一致性指数（C-index）来评估新模型和IPSS-R模型预测性能。3.第三部分回顾性分析2012年10月至2019年6月我院血液科所有MDS住院患者资料,此研究的纳入标准包括:1)年龄≥14岁;2)具有含MF评估的初诊时骨髓活检结果;3)具备完整的IPSS-R评分的参数。排除标准为诊断原发性骨髓纤维化（PMF）或重叠综合征的患者。根据患者骨髓MF的程度将患者分为无/轻度（MF-0/1）和中/重度（MF-2/3）两组,通过比较两组间临床特点、疗效及OS的差异,探讨MF对MDS预后的影响。4.统计学方法:分类变量和连续变量分别采用卡方检验和Mann-Whitney U检验。OS和无病生存（DFS）采用Kaplan-Meier（KM）法估算,Log-rank检验进行比较。Cox 比例风险模型用于时间-事件变量的风险因素分析。复发、非复发死亡（NRM）、植入和移植物抗宿主病（GVHD）累积发生率的计算和比较采用竞争风险模型（Fine-Gray）,所有统计检验均为双尾检验,显著性水平为 0.05。采用 SPSS 21.0（SPSS,Inc,Chicago,Illinois）和 R 语言软件 4.0.3 版本（R Development Core Team,Vienna,Austria）进行数据分析。三 结果1.基因突变对MDS患者预后的影响。1.1本研究总共纳入了 304例MDS患者,其中,281名（92.4%）患者至少携带1个基因突变。突变频率≥10%的基因为TET2（27%）、TP53（17%）、TET1（17%）、ASXL1（17%）、EZH2（16%）、FAT1（14%）、EP300（13%）、DDX18（12%）、CD101（11%）、SF3B1（10%）、RUNX1（10%）、U2AF1（10%）。1.2染色体核型正常组164例,核型异常组140例。正常核型组的突变基因的数目要多于异常核型组,中位数分别为4（0-16）和3（0-10）个（P=0.029）。通过相关性分析,发现 ASXL1、CD101、KDM6A、SH2B3 和IL-3RA突变更常见于正常核型组,而TET2和TP53突变则更常见于异常核型组。其中,TP53基因与复杂核型呈正相关（P值均＜0.05）。1.3具有TP53突变的患者减细胞治疗的总体有效率（ORR）要低于野生型患者的（P=0.003）。而具有EP300突变的患者ORR则高于野生型的（P=0.004）。异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）可以改善伴TP53突变患者的OS,无论是在核型正常组还是核型异常组（P值均＜0.05）。然而,allo-HSCT可能不能改善核型正常并携带DNMT3A、FAT1或IL-7R基因突变患者的 OS（P 值均＞0.05）。1.4在总的队列中,Cox多因素分析提示IPSS-R和DDX18是白血病转化的危险因素（P值均＜0.05）。在正常核型中,多因素分析提示TET2是白血病转化的危险因素（P值均＜0.05）。在异常核型中,多因素分析提示RUNX1、U2AF1和DDX18是白血病转化的独立危险因素（P值均＜0.05）。1.5在总的队列中,Cox多因素分析提示年龄、IPSS-R、TP53和DNMT3A是影响患者OS的危险因素,而allo-HSCT则是OS的保护性因素（P值均＜0.05）。在正常核型中,多因素分析均提示年龄、IPSS-R、TP53、DNMT3A、FAT1和IL-7R是影响患者OS的危险因素,而allo-HSCT则是OS的保护性因素（P值均＜0.05）。在异常核型中,多因素分析提示年龄、IPSS-R和TP53是影响患者OS的危险因素,而allo-HSCT则是OS的保护性因素（P值均＜0.05）。2.差异表达基因的功能富集及基于免疫相关基因的预后模型的建立。2.1 MDS患者与健康对照组总共存在249个差异基因,其中,上调基因162个,下调基因87个。差异表达基因经GO功能富集分析,在生物学过程分类中,排在前5的分别是白细胞活化的正向调节、细胞活化的正向调节、白细胞介导的免疫力、淋巴细胞活化的正向调节、基于免疫球蛋白受体超结构域体细胞重组的适应性免疫应答。相对低危组和相对高危组MDS患者总共存在39个差异表达的免疫相关基因,其中,上调基因32个,下调基因7个。差异表达的免疫相关基因经过GO功能富集分析,在生物学过程分类中,排在前5的分别是细胞因子介导的信号通路、对脂多糖的应答、对细菌来源的分子应答、细胞因子产生的正向调节、T细胞活化信号通路。2.2 Cox单因素分析显示存在42个免疫相关基因的mRNA表达量与患者不良预后相关,12个基因与预后良好相关。通过LASSO-Cox回归最后筛选出8个对预后影响最大的基因。基于这8个免疫相关基因建立了一个新的预后模型,Risk score=ADIPOR2× 1.9+MAPK1× 1.7+MAPK14× 1.9+INHA× 1.9+IL1β×1.6+PTH2R×2.1+IL17D×1.5+HLA-DQB1×0.4。新模型的 2 年 OS 曲线下面积（AUC）为0.903,一致性指数（C-index）为0.817,而IPSS-R模型的AUC为 0.717,C-index为 0.763。3.MF对MDS患者预后的影响。3.1本研究共纳入316例MDS患者,其中MF-2/3组43例,MF-0/1组273例。与MF-0/1组相比,MF-2/3组的复杂核型更为常见（P=0.002）。3.2在接受减细胞治疗的102例患者中,ORR为49.0%,其中MF-0/1组有90 例,ORR 为 53.3%,MF-2/3 组有 12 例,ORR 为 16.7%（P=0.017）。3.3共有141例患者接受了 allo-HSCT,其中MF-0/1组121例,MF-2/3组20例。在allo-HSCT患者中,MF-0/1和MF-2/3组的2年OS分别为68.5%（95%CI:60.1-76.9%）和 68.4%（95%CI:47.4-89.4%）（P=0.636）。在没有进行allo-HSCT的患者中,MF-0/1和MF-2/3组的2年OS分别为49.9%（95%CI:40.7-59.1%）和 19.2%（95%CI:0-39.6%）（P=0.002）。3.4在整个队列中,Cox多因素分析提示年龄（HR=1.02,P=0.003）、IPSS-R（HR=1.83,P＜0.0001）和 MF-2/3（HR=1.75,P=0.039）是影响 MDS患者OS的不利因素。四 结论1.在减细胞治疗中,TP53基因突变患者的ORR要明显低于野生型患者,而EP300基因突变患者的ORR要高于野生型患者。allo-HSCT可以改善伴TP53患者的OS,但对于正常核型并伴有DNMT3A、FAT1或IL-7R的患者可能不能从allo-HSCT治疗中获益。这提示对于伴EP300突变患者可尝试减细胞治疗,但对于TP53突变患者则建议尽快进行allo-HSCT治疗。2.与快速白血病转化相关的基因突变,在总的队列中,为DDX18基因突变,在正常核型患者中为TET2和DDX18基因突变,而在异常核型患者中,则是DDX18、RUNX1和U2AF1基因突变。3.不利于OS的基因突变,在总的队列中为TP53和DNMT3A基因突变,在正常核型患者中为TP53、DNMT3A、FAT1和IL-7R基因突变,而在异常核型组中则为TP53基因突变。4.MDS患者与健康人群差异表达的基因主要集中在免疫应答相关的通路,不同危险分层的MDS患者之间存在不同的免疫状态。免疫相关基因的mRNA表达量与MDS患者预后密切相关,利用免疫相关基因建立的预后模型表现良好,可作为IPSS-R预后模型的补充。5.MF-2/3是MDS患者预后不良的因素,allo-HSCT可能可以克服MF对患者预后的不良影响。