胆囊收缩素（cholecystokinin, CCK）是广泛分布于体内多个系统的神经肽,具有多种生物学功能,如调节摄食、焦虑、记忆等。我们在前一项国家自然科学基金项目（CCK抗炎作用的受体及信号转导机制研究No.30270529）的研究中发现,八肽CCK（cholecystokinin octapeptide, CCK-8）具有一定的免疫调节及抗炎作用,CCK-8作用于表达CCK受体的巨噬细胞,通过激活cAMP-PKA来抑制PKC活性,从而抑制NF-κB活性,抑制脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱生促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达,表明CCK-8可调节天然免疫应答。但CCK-8对适应性免疫应答有何影响尚无报道。已有报道人Jurkat T淋巴细胞表达CCK-2受体及其mRNA转录,CCK mRNA在人淋巴细胞中有转录;CCK对植物血凝素PHA（phytohemagglutinin）诱导的人外周血淋巴细胞增生具有抑制性调节作用,对丝裂原-诱导的小鼠淋巴细胞增生及淋巴细胞的移动性也具有抑制作用,而对其自发性增生和粘附力则具有促进作用。CCK及CCK受体在淋巴细胞中表达,提示CCK可能通过自分泌或旁分泌的形式调节淋巴细胞的一些功能,参与适应性免疫应答。CD4⁺T细胞在抗原刺激下,可分化为Th1和Th2两种亚群,它们各自产生特征性细胞因子,介导不同的生理过程。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β、IL-12等,介导细胞免疫、细胞毒性T细胞和巨噬细胞活化及迟发型超敏反应,刺激IgG2a抗体产生。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等Th2型细胞因子,介导体液免疫、B细胞和嗜酸性粒细胞活化以及IgG1和IgE抗体产生,抑制巨噬细胞活化和抗原呈递。Th1/Th2细胞平衡对维持机体的免疫稳态十分重要。近年来研究发现,Th1/Th2细胞失衡与多种疾病有关,参与感染性疾病（内毒素血症、SIRS、结核、寄生虫感染等）、过敏性疾病（哮喘等）、自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、葡萄膜炎等）及肿瘤等的发生、发展和预后。我们的系列研究发现,CCK-8具有一定的抗内毒素休克及缓解类风湿性关节炎的作用,但该作用是否与调节Th1/Th2细胞失衡有关尚属未知。研究CCK对Th1/Th2细胞平衡的调节作用及其机制,将有助于阐明神经免疫网络的生理及病理作用,为Th1/Th2失衡相关性疾病的临床治疗提供实验依据,具有深远的理论意义和广阔的应用前景。初始CD4⁺T细胞被激活、增殖和分化为Th0细胞。Th0细胞具有分化为Th1或Th2细胞的潜能,局部微环境中存在的细胞因子种类是调控Th0细胞分化的关键因素。IL-12可促进Th0细胞分化为Th1细胞;IL-4可促进Th0细胞分化为Th2细胞。T细胞活化及活化后产生有效的免疫应答不仅需要由TCR介导的抗原特异性信号刺激,还需要协同刺激分子介导的抗原非特异性信号刺激。在参与T细胞激活的诸多协同刺激分子中,最重要的是T细胞表面CD28与APC表面相应配体B7.1（CD80）和B7.2（CD86）的结合。B7.1和B7.2刺激T细胞增生的功能一致,但诱导T细胞分化的方向不同,B7.2优先作为Th2细胞极化的协同刺激分子,促进Th2细胞极化;B7.1则优先作为Th1细胞的协同刺激分子,因此,阻断B7.1抑制了Th1细胞极化,促进Th2细胞的极化,而阻断B7.2则引起相反的结果。因此,本课题拟观察CCK-8对静息及活化的巨噬细胞B7.1和B7.2表达及其协同刺激功能的影响,以探讨CCK-8调节Th1/Th2细胞平衡的作用是否与巨噬细胞协同刺激分子B7的表达有关。另有研究证实:NF-κB可以正向调控协同刺激分子B7.1（CD80）和B7.2（CD86）的表达。结合我们前一项国家自然基金的研究结果:CCK受体作为一种G蛋白偶联受体,可介导CCK-8激活大鼠肺间质巨噬细胞内cAMP-PKA信号通路,进而抑制NF-κB活性,实现CCK-8抗炎作用。本课题将以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象,首先从体外和体内实验分别研究CCK-8对静息和LPS活化的巨噬细胞B7.1、B7.2表达和协同刺激活性的影响,并从受体、cAMP-PKA通路、转录因子NF-κB等多个层面,系统研究CCK-8对静息及LPS作用下小鼠腹腔巨噬细胞内CCKR―cAMP―PKA―NF-κB―B7.1和B7.2表达的这一信号转导通路的影响。深入探讨了CCK-8通过干预巨噬细胞协同刺激分子的表达进而间接调节Th1/Th2平衡的机制。1 CCK-8对巨噬细胞B7.1和B7.2表达及其协同刺激功能的影响体外应用CCK-8(10^-12 mol/L¹0^-6mol/L)孵育小鼠腹腔巨噬细胞一定时间,采用流式细胞术分析细胞表面B7.1和B7.2含量的变化。用免疫磁珠从小鼠脾细胞分离CD4⁺T细胞,按4:1数量比与腹腔巨噬细胞（预先用CCK-8和/或抗B7.1抗体、抗B7.2抗体、CCK1R拮抗剂CR1409、CCK2R拮抗剂CR2945孵育24h）共同体外培养,同时加入ConA 5mg/L,采用³H掺入法测定CD4⁺T细胞增殖程度以反映巨噬细胞的协同刺激活性。结果发现:CCK-8可上调静息巨噬细胞B7.1及B7.2的表达,并增强巨噬细胞的协同刺激活性。CCK-8的作用呈剂量依赖性,最大效应剂量是在10^-7mol/L～10^-9mol/L之间。抗B7.2抗体可减轻CCK-8增强巨噬细胞协同刺激活性的作用,CCK-8主要是通过上调巨噬细胞B7.2表达而增强其协同刺激活性。体外应用CCK-8(10^-12～10^-6)mol/L和（或）脂多糖（LPS）孵育小鼠腹腔巨噬细胞,采用流式细胞术分析细胞表面B7.1和B7.2含量的变化,用免疫磁珠从小鼠脾细胞分离CD4⁺T细胞,按4:1数量比与腹腔巨噬细胞（预先用LPS、CCK-8和/或抗B7.1抗体、抗B7.2抗体孵育24h）共同体外培养,同时加入ConA 5mg/L,采用3H掺入法测定CD4⁺T细胞增殖程度。发现:CCK-8可以下调LPS诱导的巨噬细胞的B7.1和B7.2表达,抑制LPS活化的巨噬细胞的协同刺激活性。CCK-8的作用呈剂量依赖性,最大效应剂量是在(10^-7～10^-9 )mol/L之间。抗B7.1抗体和抗B7.2抗体可减轻LPS活化的腹腔巨噬细胞协同刺激活性。CCK-8通过下调LPS诱导的腹腔巨噬细胞B7.1和B7.2表达而抑制其协同刺激活性。2 CCK-8对巨噬细胞B7.1和B7.2表达的信号转导通路的研究NF-κB可以诱导协同刺激分子B7.1（CD80）和B7.2（CD86）的表达。巨噬细胞是体内重要的炎性和免疫效应细胞,而脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）是诱导巨噬细胞产生和释放炎症介质最强烈、最有效的激活物。研究表明,LPS可激活巨噬细胞cAMP-PKA信号通路并介导了一个抑制性信号,它可能抑制巨噬细胞表达一系列细胞因子,下调TNF-α和IL-1β的释放量。我们的研究证实CCK-8作用于表达CCK受体的巨噬细胞,通过激活cAMP-PKA、抑制PKC活性而抑制NF-κB活性,从而抑制脂多糖诱生促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6。CCK-8是否通过CCKR-cAMP-PKA-NF-κB通路调节巨噬细胞B7.1和B7.2的表达,目前尚未见报道。据此,本部分实验将主要观察CCK-8调节静息巨噬细胞和LPS诱导的巨噬细胞B7.1和B7.2表达的细胞内信号转导通路。本部分采用FACS检测巨噬细胞B7.1和B7.2的表达,[³H]掺入法测定CD4⁺T细胞增殖程度以反映巨噬细胞的协同刺激活性。ELISA法检测细胞内cAMP含量和PKA活性,EMSA检测小鼠腹腔巨噬细胞内NF-κB活性,Western blot检测小鼠腹腔巨噬细胞内IκB-α和p-IκB-α蛋白水平的变化。结果:（一）、NF-κB参与CCK-8对巨噬细胞B7.1和B7.2表达的调节作用。（1）NF-κB抑制剂Gliotoxin组剂量依赖性地抑制了LPS诱导的巨噬细胞B7.1和B7.2表达和LPS诱导的巨噬细胞协同刺激活性,表明NF-κB活性与LPS诱导的巨噬细胞B7.1、B7.2的表达有关,NF-κB参与调节巨噬细胞的协同刺激活性。（2）在溶剂对照组,小鼠腹腔巨噬细胞核内几乎检测不到与特异性寡核苷酸探针结合的NF-κB。用LPS孵育小鼠腹腔巨噬细胞1h,细胞内NF-κB活性明显高于溶剂对照组（P<0.01）,而用不同浓度的CCK-8(10^-6 mol/L、10^-8mol/L、10^-10mol/L)处理后,则剂量依赖性地显著地抑制了LPS诱导的NF-κB活性增高,抑制率分别为56.58%、37.26%、15.59%（P<0.05）,以LPS+CCK^-8(10^-6mol/L)组的抑制作用最为显著。不同浓度的CCK-8单独孵育小鼠腹腔巨噬细胞,10^-6mol/L和10^-8mol/L浓度的CCK-8使细胞NF-κB活性升高（P<0.05）,而10^-10mol/L的CCK-8对细胞NF-κB活性无明显影响（P>0.05）。在反应体系中加入同源性寡核苷酸（含NF-κB结合位点）及异源性寡核苷酸（含AP-2结合位点）,分别作为特异性和非特异性竞争物,以证实该实验中DNA-蛋白质结合的特异性。（3）用LPS孵育小鼠腹腔巨噬细胞30min,与溶剂对照组比较,可使胞浆中IκB-α蛋白水平明显降低而p-IκB-α蛋白水平明显增加,p-IκB-α蛋白水平/IκB-α蛋白水平比值明显增加（P<0.05）;在上述各组反应体系内加入CCK-8后,可使胞浆中IκB-α蛋白水平明显升高而p-IκB-α蛋白水平明显降低,p-IκB-α/IκB-α比值明显降低（P<0.05）;不同浓度的CCK-8单独孵育小鼠腹腔巨噬细胞,10^-6mol/L和10^-8mol/L的CCK-8使胞浆中IκB-α蛋白水平降低,p-IκB-α蛋白水平增加,导致p-IκB-α蛋白水平/IκB-α蛋白水平比值明显增加（P<0.05）;而10^-10mol/L的CCK-8对细胞内IκB-α和p-IκB-α蛋白水平均无明显影响（P>0.05）。上述结果表明:CCK-8诱导静息巨噬细胞IκB磷酸化及NF-κB活化,而抑制LPS诱导的巨噬细胞IκB磷酸化及NF-κB活化,参与巨噬细胞B7.1和B7.2的表达及其协同刺激活性。（二）、CCK-8通过激活巨噬细胞内cAMP-PKA通路调节NF-κB活性,进而调节B7.1和B7.2表达（1）用LPS孵育小鼠腹腔巨噬细胞15min或30min,细胞内cAMP含量及PKA活性升高,与对照组相比有显著性差异（P<0.01）。10^-10mol/L、10^-8mol/L和10^-6mol/LCCK-8预处理后加入LPS孵育15 min,CCK-8剂量依赖性地促进LPS引起的cAMP含量及PKA活性增加。不同浓度的CCK-8(10^-10 mol/L、10^-8 mol/L、10^-6 mol/L)剂量依赖性地增加静息小鼠腹腔巨噬细胞内cAMP含量及PKA活性,表明CCK-8可以激活cAMP-PKA。（2）在静息状态下,与对照组比较,Fsk（forskolin, cAMP激动剂毛喉素）组可以增加巨噬细胞内cAMP含量及PKA活性（P<0.05）。与CCK-8组比较,Fsk+CCK-8组cAMP含量及PKA活性升高（P<0.05）。在LPS活化的巨噬细胞内cAMP含量及PKA活性显著增高（P<0.01）, Fsk,CCK-8分别与LPS合用均可使LPS诱导的巨噬细胞内cAMP含量及PKA活性进一步明显升高（P<0.05,P<0.01）;但LPS+H89组,CCK-8+H89组,LPS+CCK-8+H89组cAMP含量分别与LPS组,CCK-8组,LPS+CCK-8组相比,cAMP含量均无明显改变,而PKA活性均下降（P<0.05）,表明Fsk可激活cAMP,升高PKA活性,而H89对cAMP含量无明显影响,却抑制PKA活性。（3）用不同刺激因素孵育小鼠腹腔巨噬细胞60min,与control组相比,LPS可以可以升高细胞内p-IκB-α蛋白表达及增强NF-κB活性（P<0.05）。单独应用CCK-8孵育小鼠腹腔巨噬细胞,在10^-6 mol/L和10^-8mol/L时,胞浆中p-IκB-α蛋白表达及NF-κB活性升高（P<0.05）。Fsk单独孵育小鼠腹腔巨噬细胞,可以升高细胞内p-IκB-α蛋白表达及NF-κB活性（P<0.05）。与control组相比,LPS+Fsk组,CCK-8+Fsk组细胞内p-IκB-α蛋白表达及NF-κB活性均升高（P<0.05）。用LPS+CCK-8共同孵育巨噬细胞,细胞内p-IκB-α蛋白表达及NF-κB活性低于LPS组（P<0.05）。H89与LPS和CCK-8共同孵育,p-IκB-α蛋白表达及NF-κB活性高于LPS+CCK-8组,且有显著性差异（P<0.01）,低于LPS组（P<0.05）。表明CCK-8通过进一步激活cAMP-PKA抑制LPS诱导的巨噬细胞NF-κB活化。（4）cAMP激动剂Fsk与CCK-8的作用相似,对静息巨噬细胞B7.1的表达无明显影响,而升高B7.2的表达;剂量依赖性地抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞B7.1和B7.2的表达,以Fsk 10^-6mol/L的作用最强。PKA抑制剂H89可以剂量依赖性地抑制CCK-8诱导的巨噬细胞表面B7.2表达,对B7.1表达无影响（P>0.05）。H89可以逆转CCK-8对LPS活化的巨噬细胞的作用,即剂量依赖性地升高巨噬细胞B7.1和B7.2表达,以LPS+CCK-8+H89 10-8mol/L的作用最强,有显著性差异（P<0.05）。表明CCK-8通过激活腹腔巨噬细胞cAMP-PKA信号通路调节B7.1和B7.2表达。以上结果表明:CCK-8通过激活cAMP-PKA-NF-κB信号通路上调B7.1和B7.2表达,增强巨噬细胞的协同刺激活性;并通过进一步激活LPS诱导的巨噬细胞cAMP-PKA-NF-κB信号通路,抑制IκB蛋白降解及NF-κB活性,下调B7.1和B7.2表达,抑制巨噬细胞的协同刺激活性。（三）、CCK-8通过CCK受体调节cAMP―PKA―NF-κB―B7信号通路（1）体外实验中,CCK1R拮抗剂CR1409及CCK2R拮抗剂CR2945均可逆转CCK-8作用下增强的巨噬细胞协同刺激活性和逆转CCK-8对LPS活化的巨噬细胞协同刺激活性的抑制作用,而且相同浓度的CR1409和CR2945相比较,CR1409的作用强于CR2945,表明CCK1R、CCK2R共同介导了CCK-8调节静息及LPS活化的巨噬细胞协同刺激活性的作用,并且CCK1R起主导作用。（2）CCK-8显著抑制了LPS诱导的巨噬细胞中IκB磷酸化及NF-κB活性增高,对NF-κB活性的抑制率达37.26%（P<0.05）。CCK1R拮抗剂CR1409及CCK2R拮抗剂CR2945均可逆转CCK-8抑制的LPS诱导的巨噬细胞内IκB磷酸化及NF-κB活性增高,即剂量依赖性地升高巨噬细胞核内p-IκB-α蛋白表达及NF-κB活性（P<0.05）,CR1409的作用强于CR2945。表明CCK1R、CCK2R共同介导了CCK-8调节LPS活化的巨噬细胞内IκB磷酸化及NF-κB活性,并且CCK1R起主导作用。（3）两种拮抗剂均能不同程度地抑制CCK-8诱导的巨噬细胞内cAMP含量增高及PKA活性升高。CR1409和CR2945在10^-9 mol·L^-1时对CCK-8的抑制作用不明显（P>0.05）,当二者浓度达到10^-7mol·L^-1以上时,细胞内cAMP含量及PKA活性较LPS+CCK-8组明显降低（P<0.01）,且有显著性差异（P<0.05）。两种拮抗剂对CCK-8的抑制效应均有剂量依赖性,CR1409的作用较CR2945强,说明两种CCK受体拮抗剂均能影响cAMP含量及PKA活性,并且CCK1R起主导作用。以上结果表明: CCK-8主要是通过上调静息巨噬细胞B7.2表达而增强其协同刺激活性,下调LPS诱导的巨噬细胞B7.1和B7.2表达而抑制其协同刺激活性,该作用由CCK1R及CCK2R介导,其中CCK1R起主要介导作用。综上,CCK-8通过激活静息巨噬细胞cAMP-PKA-NF-κB信号通路增强NF-κB活性,上调B7.1和B7.2表达,增强巨噬细胞的协同刺激活性;并通过进一步激活LPS诱导的巨噬细胞cAMP-PKA信号通路,抑制IκB蛋白降解及NF-κB活性,下调B7.1和B7.2表达,抑制巨噬细胞的协同刺激活性。CCK1R及CCK2R共同参与介导作用,其中CCK1R起主要介导作用。3体内实验CCK-8对静息和LPS活化的巨噬细胞B7.1和B7.2表达及其协同刺激功能的影响第一部分的体外实验证实了CCK-8对静息及LPS诱导的巨噬细胞B7.1和B7.2表达及其协同刺激活性的影响,本部分将从整体实验进一步验证上述结果。实验将小鼠（n=4）分为:Control组、CCK-8组、CCK-8+CR1409/CR2945组、LPS组、LPS+CCK-8组、LPS+CCK-8+CR1409/ CR2945组,分别腹腔注射（i.p.）一定剂量的N.S.,LPS和/或CCK-8及CCK1R、CCK2R,12h后按收集并纯化腹腔巨噬细胞。采用流式细胞术分析细胞表面B7.1和B7.2含量的变化;用免疫磁珠从小鼠脾细胞分离CD4⁺T细胞,按4:1数量比与上述各组腹腔巨噬细胞共同体外培养,同时加入ConA 5mg/L,采用³H掺入法测定CD4⁺T细胞增殖反映巨噬细胞的协同刺激活性。整体应用CCK-8作用小鼠腹腔巨噬细胞12h,与对照组相比,CCK-8可使小鼠腹腔巨噬细胞B7.2的表达增加,而对B7.1的表达则无影响。并且CCK-8还可使CD4⁺T细胞[³H]-TdR的掺入率升高,即促进其增殖,与对照组相比,有显著性差异（P<0.05）。小鼠腹腔注射CCK-8和/或CCKR拮抗剂,然后观察他们对于LPS i.p.（100μg/mouse）小鼠的作用,12h后收集小鼠腹腔巨噬细胞,流式细胞术检测B7的表达。与LPS组相比,CCK-8可以降低LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞B7.1和B7.2的表达（P<0.05）;并降低CD4⁺T细胞的[³H]-TdR掺入率,即抑制其增殖,说明CCK-8可降低小鼠腹腔巨噬细胞的协同刺激活性。整体应用CCKR拮抗剂可部分逆转CCK-8对巨噬细胞和LPS刺激的巨噬细胞的B7.1和B7.2表达及其协同刺激活性,以CCK1R的作用为著。综上,体内实验表明CCK-8通过上调小鼠腹腔巨噬细胞B7.2的表达而增强巨噬细胞的协同刺激活性;通过下调LPS诱导的腹腔巨噬细胞B7.1和B7.2表达而抑制其协同刺激活性,该作用由CCK1R及CCK2R介导,其中CCK1R起主要介导作用。结论本研究分别从体内实验和体外实验入手,首次系统研究了CCK-8对静息及LPS活化的小鼠腹腔巨噬细胞B7.1和B7.2表达及其协同刺激功能的影响,并从受体、cAMP-PKA、转录因子NF-κB等多个层次系统研究了CCK-8调节小鼠腹腔巨噬细胞B7.1和B7.2表达的信号转导机制,深入揭示了CCK-8发挥免疫调节作用的机制。1、体内及体外实验证实,CCK-8主要通过上调小鼠腹腔巨噬细胞B7.2表达而增强其协同刺激活性;通过下调LPS诱导的巨噬细胞B7.1和B7.2表达而抑制其协同刺激活性。CCK-8调节巨噬细胞的协同刺激活性与B7.1和B7.2表达密切相关。2、CCK-8通过激活静息巨噬细胞cAMP-PKA-NF-κB信号通路增强NF-κB活性,上调B7.1和B7.2表达,增强巨噬细胞的协同刺激活性;并通过进一步激活LPS诱导的巨噬细胞cAMP-PKA-NF-κB信号通路,抑制IκB蛋白磷酸化及NF-κB活性,下调B7.1和B7.2表达,而抑制巨噬细胞的协同刺激活性。CCK1R及CCK2R共同参与介导作用,其中CCK1R起主要介导作用。因此,CCK-8通过干预巨噬细胞协同刺激分子的表达影响Th细胞的功能,这可能是CCK-8发挥免疫调节作用的机制之一。