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糖尿病肾病是糖尿病的重要并发症之一,最终发展为终末期肾病。糖尿病肾病的进程中伴随着肾小球和肾小管的功能受损以及纤维化,本文主要目的是探究钙调磷酸酶调节蛋白1（regulator of calcineurin1,RCAN1）在糖尿病肾病进程中调控肾小管纤维化的分子机制,为糖尿病肾病的治疗提供新的靶点。首先,我们探究了RCAN1的亚型RCAN1.1s和RCAN1.4调控肾小管上皮细胞胞外基质增多的信号通路。分别构建真核表达载体p LHCX-RCAN1.1s和p LHCX-RCAN1.4,瞬时转染肾小管上皮细胞系HK-2细胞。蛋白质免疫印迹法检测蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,m TOR）、核糖体S6蛋白激酶（ribosomal protein S6 kinase,S6K）、核糖体S6蛋白（ribosomal protein S6,S6）、真核翻译起始因子4E结合蛋白1（eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1,4EBP1）的磷酸化水平,以及胞外基质纤连蛋白（fibronectin,FN）和IV型胶原蛋白（type IV collagen,Col IV）的表达情况。结果发现过表达RCAN1.1s和RCAN1.4上调了HK-2细胞中FN和Col IV的表达,并且激活了Akt/m TOR/S6K/S6信号通路。为了进一步证实RCAN1.1s和RCAN1.4激活了Akt/m TOR/S6K/S6信号通路,我们采用小干扰RNA敲低RCAN1,然后蛋白质免疫印迹法验证Akt/m TOR/S6K/S6信号通路的激活。结果发现敲低RCAN1的HK-2细胞中Akt/m TOR/S6K/S6信号通路被部分抑制。此外,我们用m TOR的抑制剂雷帕霉素和Akt的抑制剂LY294002分别预处理HK-2细胞,随后转染p LHCX-RCAN1.1s或p LHCX-RCAN1.4,蛋白质免疫印迹法检测S6K和S6的磷酸化水平,以及胞外基质FN的表达。结果显示m TOR下游通路S6K/S6被抑制,FN的表达下调。以上结果证明RCAN1.1s和RCAN1.4通过Akt/m TOR/S6K/S6信号通路参与调控HK-2细胞中胞外基质的表达。随后,我们探究了RCAN1.1s和RCAN1.4激活Akt/m TOR信号通路的分子机制。我们实验发现过表达RCAN1.1s和RCAN1.4的HK-2细胞中胞浆和线粒体活性氧（reactive oxygen species,ROS）产生均增多,线粒体膜电位降低。结果表明RCAN1.1s和RCAN1.4引起HK-2细胞的氧化应激增强,线粒体功能受损。共聚焦和透射电子显微镜观察过表达RCAN1.1s和RCAN1.4的HK-2细胞线粒体形态,发现线粒体结构受损,碎片化增加,蛋白免疫印迹法检测到线粒体中分裂相关蛋白动力蛋白相关蛋白1（dynamin-related protein 1,Drp1）的蛋白水平上调、融合相关蛋白视神经萎缩1（optic atrophy1,Opa1）和线粒体融合蛋白2（mitochondrial fusion protein2,Mfn2）的蛋白水平下调。结果表明过表达RCAN1.1s和RCAN1.4促进线粒体分裂,破坏线粒体动力学平衡。线粒体ROS的特异性抑制剂Mito-TEMPO和Drp1的抑制剂Mdivi1分别预处理HK-2细胞,之后瞬时转染p LHCX-RCAN1.4,蛋白质免疫印迹法检测Akt、m TOR的磷酸化水平及FN的表达。结果发现过表达RCAN1.4的HK-2细胞中抑制线粒体ROS的产生和Drp1的表达后Akt/m TOR信号通路被抑制,胞外基质FN的表达下调。以上结果表明RCAN1.4和RCAN1.1s过表达诱导HK-2细胞氧化应激,破坏线粒体结构和功能,进而激活Akt/m TOR信号通路调控胞外基质的表达。最后,我们探究RCAN1.1s在链脲佐菌素（streptozocin,STZ）诱导的糖尿病肾病小鼠肾脏纤维化进程中的调控作用。免疫荧光检测RCAN1.1s在肾脏中的定位,发现RCAN1.1s在STZ模型小鼠肾小管中高表达。我们采用Cre-Loxp重组酶系统筛选出肾小管特异性过表达RCAN1.1s的小鼠品系-RCAN1tec OX。免疫组化检测STZ造模小鼠和RCAN1tec OX小鼠肾皮质中RCAN1、FN和平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）的表达,过碘酸雪夫染色、马松三色染色和天狼星红染色分别观测小鼠肾损伤及纤维化情况。结果显示RCAN1tec OX小鼠和STZ造模小鼠肾小管发生病变,肾小管管腔皱缩,基底膜异常增厚,FN和胶原蛋白增多,肌成纤维细胞激活。蛋白质免疫印迹法检测发现STZ造模小鼠和RCAN1tec OX小鼠肾皮质中Akt、m TOR的磷酸化水平上调,表明Akt/m TOR信号通路在STZ造模小鼠和RCAN1tec OX小鼠肾皮质中被激活。此外还发现促分裂蛋白Drp1表达增高,促融合蛋白Opa1和Mfn2表达降低。以上结果初步证实过表达RCAN1.1s在小鼠肾脏中促进线粒体分裂,激活Akt/m TOR信号通路,调控肾小管间质纤维化。综上结果证明RCAN1.1s和RCAN1.4通过诱导氧化应激和线粒体分裂激活Akt/m TOR/S6K/S6信号通路调控HK-2细胞胞外基质的表达,参与糖尿病肾病肾小管间质纤维化。