研究背景和目的结直肠癌发病率在恶性肿瘤中排名第三,死亡率排名第二。中国是结直肠癌发病大国,发病率和死亡率在近十年均有所上升。虽然诊断与治疗手段有所改观,但大部分患者诊断时处于中晚期,治疗效果不理想,发病和转移机制有待进一步研究。越来越多研究表明,miRNA参与结直肠癌的发生发展,有研究发现miR-500a-5p与肿瘤细胞生长和侵袭存在密切关系,但在结直肠癌中的表达及调控机制仍然未知。我们发现miR-500a-5p在结直肠癌细胞中明显下调;HDAC2可能是其靶基因;miR-500a-5p启动子存在多个YY1结合位点,YY1可能是其上游转录因子。本课题将在分子相互作用、细胞功能、动物实验和肿瘤病人组织标本相关性四个层次上展开研究,旨在明确miR-500a-5p对结直肠癌生物学特性的影响,探索其作用机制,确定转录复合物YY1/p300/HDAC2对miR-500a-5p表达的调控,为寻找结直肠癌早期诊断标志物和潜在药物治疗靶点提供线索。研究内容和方法1.应用实时荧光定量PCR技术,检测miR-500a-5p在结直肠癌组织中的表达并评估其与结直肠癌患者临床病理学特征及预后的相关性;转染mimics抬高或者inhibitor抑制miR-500a-5p的表达,采用EdU、平板克隆实验观察细胞增殖能力的变化,使用流式细胞术和WB检测相关周期蛋白的表达评估细胞周期进程,检测细胞迁移能力的改变使用划痕实验、transwell小室迁移实验。2.利用生物信息学和mRNA芯片、双荧光素酶报告基因系统,验证miR-500a-5p与HDAC2的靶标关系;使用平板克隆、transwell小室迁移以及裸鼠皮下成瘤实验评估miR-500a-5p通过HDAC2对细胞体外生物学行为和成瘤性的影响;实时荧光定量PCR检测miR-500a-5p和HDAC2在结直肠癌组织中表达的相关性。3.生物信息学预测miR-500a-5p的上游调控因子,双荧光素酶报告系统和ChIP实验检测YY1与miR-500a-5p启动子直接结合;qPCR评估转录因子YY1负调控miR-500a-5p的表达以及YY1和miR-500a-5p在结直肠癌组织中的表达相关性。4.Co-IP检测p300、HDAC2和YY1的结合;qPCR和双荧光素酶活性检测评估YY1/HDAC2/p300转录复合物对miR-500a-5p启动子转录活性的影响;ChIP、re-CHIP验证转录复合物与miR-500a-5p启动子结合情况。5.应用流式细胞术和Western blot,体外检测miR-500a-5p是否影响结直肠癌细胞对FK228的敏感性;TUNEL染色评价miR-500a-5p和FK228联合应用对体内移植瘤凋亡的影响。实验结果1.miR-500a-5p在结直肠癌组织和细胞中表达下调,表达水平与肿瘤分化程度、淋巴结转移、AJCC分期和病人预后相关,过表达miR-500a-5p抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移,延缓细胞周期进程,抑制其表达则相反。2.miR-500a-5p靶向HDAC2促进结直肠癌细胞体外增殖、迁移能力和体内成瘤能力。3.YY1负向调控miR-500a-5p的表达,参与形成转录因子复合物。YY1/p300/HDAC2 复合物调控 miR-500a-5p 的表达。4.miR-500a-5p能增强结直肠癌细胞对FK228的敏感性。结论miR-500a-5p在结直肠癌发生发展过程中扮演抑癌基因的角色,靶向HDAC2抑制结直肠癌细胞增殖和迁移,转录因子复合物YY1/p300/HDAC2正反馈调节miR-500a-5p的表达。