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超保守RNAs(UCRs)属于长链非编码RNA(lncRNA),有481个超过200bp左右的片段在人类、大鼠和小鼠中是100%保守的。这使得以动物为模型的研究结果更加接近患者,更富临床意义。大部分UCRs可以转录,称为超保守转录子(T-UCRs)。近几年癌症的发病率和死亡率呈显著上升趋势,有些许文章报道T-UCRs参与肿瘤的发生和凋亡,在癌症的诊断和治疗中起着越来越重要的作用。本课题采用前期建立好的p53功能缺失小鼠模型,得出现象：激活p53功能后,T-uc.475在淋巴瘤中的表达降低；T-uc.475全长397bp,位于氧联乙酰葡萄糖胺转移酶(OGT)蛋白编码基因的外显子4和5之间的内含子中,通过染色质免疫共沉淀(CHIP)实验得出p53可直接与OGT启动子序列结合,从而调控T-uc.475的表达；通过体外和体内实验分别论证T-uc.475具有促进肿瘤生长的作用；并且经过mRNA和蛋白水平验证了OGT和T-uc.475具有协同作用。因此p53可通过OGT来调节T-uc.475的表达从而起到抑制癌细胞生长的作用,并且T-uc.475可通过影响OGT来影响血细胞之间的转化。本课题研究内容可分为两个部分：第一部分研究T-uc.475是否受到p53的直接调控目的.:找出p53的靶基因及相关分子生物学途径,利用前期建立好的p53可控表达的淋巴瘤模型,采用染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,CHIP)的方法确定p53转录因子是否直接结合到可能的p53结合位点上。方法：在OGT的启动子和T-uc.475的上游2个kb区域找出p53可能的结合位点,分别设计两对引物用以做实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的分析。将前期从myc和p53可控表达的淋巴瘤模型取出的肿瘤细胞p53ER2接种到p53ER-KI小鼠中,打4-OHT 0h后1.5h以后取出肿瘤,用70μm过滤网研磨出肿瘤细胞后,离心去上清,培养基重悬细胞后,用甲醛,蛋白抑制剂等处理,PBS重悬,用细胞超声仪击碎DNA片段,采用试剂盒做CHIP实验,最后用得到的DNA和之前设计好的引物去qRT-PCR,分析结果。结果：qRT-PCR结果显示,p53与OGT可能的结合部位相比较未结合的显示高表达,而T-uc.475却没有变化。p53激活1.5h以后,OGT启动子序列表达增高,uc.475表达无差异;p53未激活,OGT、T-uc.475启动子序列表达均无差异。结论：p53可与OGT启动子序列直接结合,与T-uc.475启动子无结合位点。p53激活后,可与OGT启动子序列结合,与T-uc.475启动子无结合位点；p53未激活时,和OGT、T-uc.475均无法结合。由此可以得出OGT受p53的直接调控,又因T-uc.475位于OGT基因中,因此p53可通过OGT来调控T-uc.475的表达。第二部分研究T-uc.475在B淋巴瘤细胞中的功能目的：根据长链非编码RNA:T-uc.475在B淋巴瘤细胞中的表达情况,通过过表达或敲低T-uc.475的方法,体内体外实验相结合,来进一步探究T-uc.475的生物学功能。方法：运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测长链非编码RNAT-uc.475和OGT在不同B淋巴瘤细胞和石蜡切片组织中的表达情况；构建和克隆uc.475-MSCV-PIG质粒,通过短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)技术构造shlnc-uc.475-shRNA质粒,测序,扩增质粒；将质粒转染到293T细胞中,运用qRT-PCR技术检测T-uc.475有无过表达,检测shlnc-uc.475-shRNA有无低表达；人工制造uc.475-MSCV-PIG逆转录病毒,人工制造shlnc-uc.475-shRNA逆转录病毒；感染B电淋巴瘤细胞3889,使用倒置显微镜查看荧光,用流式细胞仪检测感染效率,用嘌呤霉素筛选后使得感染效率约为100%；体外用流式细胞仪检测周期,凋亡,细胞计数；体内将感染3889的淋巴瘤细胞皮下接种到BALB/c小鼠,一周后取出肿瘤做免疫组化和WB实验。结果：运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测出长链非编码RNAT-uc.475和OGT在不同B淋巴瘤细胞和石蜡切片组织弥漫性大B中均高表达。克隆T-uc.475和shlnc-uc.475-shRNA后,测序比对100%；转染293T细胞后,qRT-PCR技术检测T-uc.475相对于空载体对照表达增高,shlnc-uc.475-shRNA相对于空载体对照表达降低;感染B淋巴瘤细胞3889后,有绿色荧光且流式细胞仪检测感染效率为30%-40%,用嘌呤霉素筛选后感染效率为100%；细胞体外培养时,过表达T-uc.475后流式细胞仪检测S期,DNA合成量增多；敲低T-uc.475后流式细胞仪检测S期,DNA合成量减少；过表达T-uc.475后细胞凋亡减少,敲低T-uc.475后细胞凋亡增多；过表达T-uc.475后细胞生长迅速,敲低T-uc.475后细胞生长缓慢。体内种瘤后,过表达T-uc.475的肿瘤长得快,敲低T-uc.475的肿瘤长得慢；免疫组化分析也显示过表达T-uc.475后,细胞增殖迅速,凋亡缓慢;敲低T-uc.475后,细胞增殖缓慢,凋亡迅速。Western blot实验和免疫组化实验反应了过表达T-uc.475后,OGT表达增高。结论：长链非编码RNA T-uc.475和OGT在B淋巴瘤细胞和石蜡切片组织弥漫大B中高表达,过表达T-uc.475后,可以促进肿瘤生长,可以使OGT表达增高；敲低T-uc.475后,肿瘤生长缓慢,这说明T-uc.475是一个促癌的基因,且T-uc.475和OGT具有协同作用。