背景与目的 已知 Wnt 信号途径是一种对细胞增殖和分化具有重要调节作用的信号传导系统,包括信号启动、分子传递、靶基因转录活化等几个主要环节,是一个由多种分子参与、相互影响、相互制约和协同作用的复杂体系。越来越多的研究证明,Wnt 途径除了参与调控发育过程以外,与肿瘤的发生发展也有密切的关系。当前的一系列的研究证实,在该途径的几个主要环节中,最具代表性和规律性的因子为以下几个:1,分泌性 Wnt 蛋白是该途径的启动因子。Wnt 蛋白是多基因家族,其中与细胞增殖分化关系较为密切的是 Wnt2 蛋白。Wnt 蛋白与其胞膜受体(Frizzled)结合后,即可将信号由胞外传至胞内,通过 Wnt 途径中不同组分的相互作用,传递信息。2,多功能蛋白分子 β-catenin,一方面与跨膜分子 E-cadherin形成 cadherin-catenin 复合物,定位于细胞膜,参与细胞-细胞粘附作用;另一方面也是 Wnt 途径的成员,当 Wnt 途径激活后,该途径的主要因子 APC(adenomatouspolyposis coli)和 GSK3(glycogen synthase kinase3)等发生结构改变,以致胞浆内游离的 β-catenin 不能发生磷酸化,而非磷酸化的 β-catenin 因不能被蛋白酶降解而在胞浆内积聚,进而通过其胞浆-胞核的易位,使核内转录因子 TCF/LEF (T cell factor/lymphoid enhancer factor)活化而启动 Wnt 途径的生物学效应。因此 β-catenin 被认为是 Wnt 信号途径的中心环节或信使。3,β-catenin 与核内转录因子 TCF/LEF 形成复合物后,Wnt 途径的相关靶基因即可开始转录。这些靶基因包括细胞周期和凋亡相关基因,生长因子和粘附分子等,均与肿瘤的发生发展密切相关,其中以CD44 和基质金属蛋白酶(matrix metalloproternase, MMPs) 等与肿瘤侵袭转移有关 ·1··2·的因子较具有代表性。综观 Wnt 途径参与肿瘤发生发展的研究资料可以发现,虽然已对多种不同肿瘤的细胞系、临床病例或动物模型进行观察研究,但所涉及的深度、广度、实验结果和相应的结论尚不尽相同。由于肿瘤具有一定的地域分布特点,欧美国家的大量研究偏重于结肠癌和乳腺癌,有关胃癌的研究相对较少。然而,胃癌是我国最常见的恶性肿瘤,因其较强的侵袭和远距离转移的趋向而居于癌症致死原因之首位。因此,最近几年 Wnt 信号传导途径与胃癌发生发展关系的研究开始引起关注。当前有关胃癌中 Wnt 信号通路的异常激活,特别是中心环节 β-catenin 易位表达的特点及其意义,虽已形成共识,但与胃癌恶性程度,尤其与侵袭和转移关系的研究,不仅较少而且存在结论相反的争议。Wnt 途径相关因子的研究也多限于选择 1-2 个因子所进行的单效应计数观察。同时,Wnt 途径关键环节中其他的因子,如 Wnt 蛋白和 TCF,在胃癌组织中的表达情况及与胃癌生物学行为的关系,则罕有报道。本课题以临床胃癌术后标本和4个胃癌细胞系为研究对象,胃癌组织按Lauren法分为肠型和弥漫型两个亚型,并以癌前期病变(萎缩性胃炎和肠上皮化生)和癌旁非癌粘膜为对照,对 Wnt 途径中三个主要环节的代表因子,Wnt2、β-catenin、TCF4和靶基因 CD44v6,从 RNA 和蛋白水平进行总合研究和分步观察,在同一标本上就上述各因子在胃癌中的异常表达及其与癌细胞的侵袭和淋巴结转移情况进行平行性的研究和相关性分析,以获得切实的研究资料,并对 Wnt 信号途径与胃癌发生发展,特别是与侵袭和转移的关系形成更为可信的论证,进而为胃癌的发病机制、早期诊断、预后判断、治疗方法的选择等提供新的理论依据。材料和方法胃癌组织标本选自大连医科大学肿瘤研究所(省高校癌症基因组学重点实验室)建立的人癌组织库。本研究基于冰冻组织微阵列和石蜡组织微阵列,结合组织特定区域的 RNA/蛋白定点捕获,应用免疫组化、RT-PCR、western 蛋白印迹分析等方法,平行检测 Wnt2、β-catenin、E-cadherin、TCF4 和 CD44v6 在胃癌中的表达情况。采用单核苷酸多态性分析(PCR-SSCP)结合基因测序,检测 β-catenin 外显子 3 的突变情况。实验数据应用 Kruskal-Wallis 和 Mamm Whitney 检验方法对上述指标在不同胃癌组织中的表达进行统计分析,Spearman 相关分析用于检测其相关性。·3·结果一.β-catenin 在胃癌中的易位表达及与肿瘤侵袭深度的关系1.胃癌组织呈现膜 β-catenin 染色减少乃至消失 (94.6%, 52/55), 73%(40/55)呈胞浆内积聚,49%(27/55)有核内易位, 与非癌组织比较均具有显著差别(P<0.01)。2.胃癌标本全层切片观察发现,随着癌细胞的侵袭深度,其膜上 β-catenin 染色明显减少,并伴随出现核内 β-catenin 的积聚。3.PCR-SSCP 分析结果显示,所测标本无论有无 β-catenin 核易位,均未发现某些文献报道的 β-catenin 外显子 3 的突变。二.Wnt2 和 β-catenin 的异常表达与胃癌发生发展的关系1.胃癌组织可见 Wnt2 的表达和 β-catenin 的胞浆/胞核积聚,肠型和弥漫型胃癌无明显差别。Wnt2 的高表达(++-+++)和 β-catenin 的核积聚在肠型胃癌的检出率为 68%(13/19)和 58%(11/19),弥漫型胃癌为 47%(9/19)和 47%(9/19)。2.临床资料显示有淋巴结转移(LN+)的胃癌标本,其 Wnt2 强表达(69%,18/26)和 β-catenin 核易位(65%,17/