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菌核病是我国油的主要油菜病害之一,对我国油菜生产造成了严重的影响;对于油菜对菌核病的反应机制的研究有助于我们了解油菜-菌核病互作,对于我们油菜抗病育种具有重要意义。研究工作主要分两个方面进行的:1.核盘菌在侵染植物时会分泌草酸以帮助其入侵植物组织,而草酸氧化酶可以分解草酸为二氧化碳和过氧化氢,我们通过农杆菌转化的方法将大麦草酸氧化酶(Y14203)转入甘蓝型油菜,提高了对菌核病的抗性。在接种核盘菌72h后,与对照相比,转基因植株的病斑面积减少15-61%,表现出对核盘菌显著的叶片抗性。而且,转基因植株接种核盘菌后的草酸盐水平下降,同时伴随过氧化氢水平的上升。另外,涉及到过氧化氢信号路径的基因表达水平在转基因植株中表现出上升的趋势。因此,我们将转化大麦草酸氧化酶基因提升抗性的原因归结为增强植株对草酸盐的代谢升高的过氧化氢水平以及过氧化氢信号路径上的基因表达水平的上升。2.基于本实验室之前抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)的结果,检测并分离到一个受到核盘菌诱导上调表达的基因Bn WRKY33;基于内含子多态性标记,将其定位于A5连锁群上;在Westar材料中过表达Bn WRKY33可以提高核盘菌抗性,而且在转基因植株中合成camalexin的基因表现出上调表达;对其启动子分析发现其受到水杨酸及核盘菌的诱导,对启动子进行截短实验获得含有3个W-box的受到核盘菌诱导的区段,利用这个区段进行酵母单杂交筛选Bn WRKY33上游调控其转录水平的转录因子,结果筛选到一个与At WRKY15同源的WRKY转录因子Bn WRKY15;利用EMSA和拟南芥原生质体瞬时表达验证了这种互作的真实性,同时也检测到Bn WRKY33与这段区域的结合;转录激活检测发现Bn WRKY15是一个弱的转录激活子,而Bn WRKY33是一个典型的转录激活子,转录激活/抑制结构域作图发现Bn WRKY33存在两个转录激活结构域,而Bn WRKY15存在一个转录抑制结构域;Bn WRKY15在拟南芥原生质体中会降低Bn WRKY33对自身的转录激活,同时在Bn WRKY15过表达植株中Bn WRKY33及其调控合成camalexin相关的基因都表现出表达量下降的情况,并且过表达植株的菌核病抗性初步鉴定也表现出抗性下降;利用转录激活和EMSA竞争性试验研究发现Bn WRKY15对Bn WRKY33对自身激活能力的影响机制可以归结为两个方面:1.Bn WRKY15抑制Bn WRKY33的转录激活能力;2.Bn WRKY15与Bn WRKY33一起竞争WRKY33启动子上的W-box,而且Bn WRKY15具有更强的W-box结合能力。另外,也检测到受核盘菌诱导表达的Bn WRKY28和Bn WRKY40也可以结合到Bn WRKY33的启动子上,说明Bn WRKY33在植物环境的刺激反应中可能处于调控的中心。