茶树倍性鉴定体系的建立

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本文初步研究了茶树花药培养的方法,建立了基于FISH技术的茶树倍性检测体系及流式细胞技术的基因组DNA含量测定方法,具体研究成果如下:  茶树花药培养在本实验室前期花药培养工作基础上,进一步优化培养基,以“舒茶早”、“福云6号”为试材,研究了不同浓度肌醇对花药培养的影响。结果表明,过量肌醇促进愈伤组织大量形成,不利于茶树花药培养。本研究得到了花药粒膨大,无愈伤形成的花药离体培养试材,为进一步诱导其内花粉再生成器官或组织提供了试材。  茶树染色体制片以“舒茶早”为试材,建立了一套基于茶树无性系根尖的简单、高效的染色体制片技术:上午10点左右取茶树根尖,通过8-羟基喹啉4℃冰箱下预处理4小时,用卡诺氏溶液4℃冰箱中固定4小时,然后放在1mol/L的盐酸解离5min,苯酚品红染色10min后敲片、压片,显微镜观察。  原位杂交以荧光标记的小麦45S rDNA为探针,获得了“舒茶早”根尖原位杂交图上的6个(3对)信号点,由此推断“舒茶早”是二倍体品种。  DNA含量的测定从DNA含量已知的鸡血红细胞、玉米、大豆中筛选出适合茶树DNA含量测定的内参—大豆,以大豆(品种Polanka2C=2.5 pg)为内参,测得包括“舒茶早”、“白毫早”、“龙井43”、“特香早”、“福鼎大白茶”、“谷雨香”等十几种茶树品种的DNA含量。  以“龙井43”为参照,对“舒茶早”、“白毫早”、“福云6号”,“政和大白茶”、“杭州大叶”以及“上浮洲”愈伤组织的倍性进行了鉴定。结果表明,“舒茶早”、“白毫早”、“福云6号”为二倍体,“政和大白茶”、“杭州大叶”为三倍体,“上浮洲”愈伤组织为四倍体。  茶树不同组织DNA含量的测定以“舒茶早”为试材,流式细胞检测结果表明其花瓣、嫩叶以及花丝的DNA相对含量略有不同,但都可以作为倍性鉴定的试材,相对于幼叶,花瓣、花丝因次生代谢产物干扰较少,更适于流式细胞检测。  低温胁迫对流式细胞测定结果的影响以“舒茶早”为试材,将叶片置于4℃冰箱中分别处理2h、4h、8h、12h、24h,结果表明随着低温处理时间延长,各处理DNA含量不断降低,说明低温胁迫处理影响流式细胞DNA含量测定结果。将低温处理12h的“舒茶早”叶片置入25℃恒温箱内分别放置2h、4h、8h、12h和24h后,测定各样品DNA含量,结果表明25℃恒温处理12h后,“舒茶早”叶片的相对DNA含量基本恢复正常。
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