论文部分内容阅读
目的:谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统内一种主要的兴奋性神经递质,通过作用于一系列的兴奋性氨基酸受体在神经元通信以及神经病理性损伤方面发挥重要作用。兴奋性氨基酸转运体是调控脑内细胞外液谷氨酸浓度的重要机制,其中星形胶质细胞谷氨酸转运体-1 ( Glial glutamate transporter-1, GLT-1)在终止谷氨酸能神经传递,维持细胞外液谷氨酸浓度处于正常水平方面发挥重要作用。本室研究发现,在大鼠脑缺血耐受模型中,脑缺血预处理(cerebral ischemic preconditioning, CIP)可抑制全脑缺血打击引起的海马CA1区锥体神经元的迟发性死亡(delayed neuronal death, DND),同时上调海马CA1区GLT-1的表达、降低脑缺血打击后海马CA1区细胞外液中的谷氨酸浓度,并且DHK(GLT-1的特异性抑制剂)和GLT-1的反义寡核苷酸则能剂量依赖性的阻断CIP对神经元的这种保护作用。这些结果提示,GLT-1在CIP脑保护机制中发挥重要作用。但是,在CIP诱导脑缺血耐受过程中,GLT-1转运体的功能,包括与谷氨酸的结合特性以及对谷氨酸的摄取是否发生变化,尚未见研究报道。因此,本实验采用脑组织病理学方法、放射性配基结合方法、L-3H-glutamate标记法,在确定CIP诱导脑缺血耐受的基础上,观察这一过程中GLT-1转运体的数量和亲和力以及对谷氨酸的摄取的变化,为阐明GLT-1在脑缺血耐受诱导中的作用提供进一步的实验依据,为临床上脑血管疾病的防治研究提供新的线索和思路。方法:200只永久凝闭双侧椎动脉的(Control组大鼠除外)Wistar大鼠(280~300 g)随机分为以下5组:(1) Control组(n=12):不做任何处理;(2) Sham组(n=47):行全脑缺血的sham手术,即只分离暴露、但不夹闭双侧颈总动脉。(3) CIP组(n=47):全脑缺血3 min作为CIP,之后恢复脑血液再灌流。(4)脑缺血打击组(n=47):全脑缺血8 min作为脑缺血打击,之后恢复脑血液再灌流。(5) CIP+脑缺血打击组(n=47):首先行CIP 3 min,恢复脑血液再灌流2天后,行全脑缺血8 min后恢复脑血液灌注。除control组外,以上各组于sham手术或末次脑缺血再灌注后0 h、1 h、1 d、2 d、3 d、5 d、和7 d取材观察。其中7 d组动物(n=5)用于观察海马CA1区组织病理学变化;其余各组(n=7)用于GLT-1功能的测定,其中4只动物用于GLT-1的数量和亲和力的测定,3只动物用于GLT-1对谷氨酸摄取率的测定。采用四血管闭塞法制造大鼠全脑缺血模型。首先凝闭双侧椎动脉,2天后夹闭双侧颈总动脉致大鼠全脑缺血;夹闭双侧颈总动脉3 min作为CIP,夹闭8 min作为脑缺血打击;二者都给予时间隔2d。全脑缺血的sham手术包括除不夹闭双侧颈总动脉以外的所有步骤。海马CA1区组织病理学变化采用常规组织学切片、硫堇染色,光镜下确定组织学分级和神经元密度,评价DND发生情况。组织学分级(histological grade, HG)标准如下:0级,无神经元死亡;Ⅰ级,散在神经元死亡;Ⅱ级,成片神经元死亡;Ⅲ级,几乎全部的神经元死亡。计数海马CA1区每1 mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目,每张切片双侧海马各计数3个区段取平均数为神经元密度(Neuronal density, ND)。GLT-1的数量和亲和力的测定采用放射性配基结合法,分别以Bmax和Kd值表示,以总结合减去非特异性结合计算GLT-1的Bmax和Kd值。Bmax值越大,表明GLT-1的数量越多;Kd值越小,表明GLT-1对谷氨酸的亲和力越大。对谷氨酸摄取率的测定采用3H-标记谷氨酸法,以总摄取减去非特异性摄取作为GLT-1对谷氨酸的摄取。结果:1 CIP减轻全脑缺血引起的海马CA1区锥体神经元DND Control组与Sham大鼠海马CA1区无锥体神经元死亡,HG均为0级,ND值分别为208±11.31和198.67±9.35。CIP组大鼠海马CA1区组织学特征与control和sham组大鼠类似,HG为0～Ⅰ级,ND值为192±18.93。脑缺血打击组大鼠海马CA1区出现明显的DND,与以上三组相比,HG(Ⅱ～Ⅲ级)明显升高(P<0.01),ND值(29.33±13.06)显著降低(P<0.01)。CIP+脑缺血打击组海马CA1区DND不明显,与脑缺血打击组相比,HG(0～Ⅰ级)明显降低(P<0.01),ND值(166.67±10.98)显著升高(P<0.01),表明CIP可以诱导海马CA1区神经元产生缺血性耐受,对抗缺血打击引起的DND。2 CIP增加大鼠海马CA1区GLT-1的数量和亲和力2.1 Bmax值的变化与正常control组相比,Sham组Bmax值有一定程度的升高,特别是在sham手术后1d至3d(P<0.05),表明sham手术对GLT-1的数量有一定影响。CIP组Bmax值明显升高,2d时达到高峰(P<0.05 vs 0h、1h和24h),并可持续至CIP后5d,与sham组同时间点相比均显著增加(P<0.05)。脑缺血打击后Bmax呈现下降趋势,3d时降至最低(P<0.05 vs 0h和1h组);与sham组相比,脑缺血打击后0h和1h的Bmax值虽有一定程度的升高,但无统计学意义,而脑缺血打击后2d、3d和5d组的Bmax值则较sham组同时间点显著降低(P<0.05)。CIP+脑缺血打击组Bmax值变化趋势同CIP组,但末次脑缺血后24h即开始升高(P<0.05 vs 0h和1h组),2d时达到高峰,并持续到全脑缺血后5d;除0h组外,其余各时间点均较脑缺血打击组显著增加(P<0.05);此外,与CIP组相比,除0h、1h和5d组外,其余各时间点均显著增加(P<0.05)。2.2 Kd值的变化与control组相比,sham组在各个时间点的kd值均无显著性变化。与sham组相比,CIP后2d的Kd值显著降低(P<0.05),而脑缺血打击组的Kd值则有升高趋势,尤以脑缺血打击后2d(P<0.05)最为显著,至5d时基本恢复至sham组水平。而在脑缺血打击前预先给予CIP(CIP+脑缺血打击组),则可明显抑制脑缺血打击引起的Kd值的升高,表现为除3d和5d外,其余各时间点的Kd值均较脑缺血打击组显著降低(P<0.05)。3 CIP提高大鼠海马CA1区GLT-1对谷氨酸的摄取率与control组相比,Sham组的谷氨酸摄取率在各个时间点无明显差别。CIP后,谷氨酸的摄取明显增加(P<0.05),尤以CIP后的早期;随时间的推移,谷氨酸的摄取逐渐下降,但5d时仍高于sham组。脑缺血打击组谷氨酸的摄取率呈现下降趋势,以3d时较为明显。CIP+脑缺血打击组谷氨酸的摄取变化趋势与CIP组类似,但谷氨酸摄取的增加更加明显,并且在5d时仍保持在较高水平。结论: CIP可以通过增加GLT-1转运体的数量、与谷氨酸的亲和力和对谷氨酸的摄取,发挥抗全脑缺血性脑损伤作用。