目的第一部分HCMV先天性潜伏感染Balb/c小鼠免疫功能检测:对HCMV先天性潜伏感染Balb/ c模型小鼠进行病毒再激活处理后,采集鼠外周血进行HCMV感染状态及免疫功能状态检测,以期探索该小鼠模型在临床相关疾病中的应用价值。第二部分pp65截短抗原在肾移植标本检测中应用的研究:对肾移植患者HCMV感染状态进行检测,分析比较本室自制pp65 ELISA试剂盒的特异性和敏感性,以期评价其在临床上的实用价值。方法第一部分:随机选取先天性潜伏感染模型小鼠6只,每只给予腹腔注射环磷酰胺(剂量150mg/kg,每周1次,共3次),使其感染状态成为潜伏感染再激活的状态;实验分组为三组,即:HCMV先天性潜伏感染组(A组)、HCMV先天性潜伏感染再激活组(B组)及HF细胞对照组(C组)24~26月龄雌性小鼠各6只,眼眶取血并引颈处死,使用淋巴细胞分离液分离血液中的外周血单核细胞。分别作如下试验:(1)病毒分离与鉴定:吸取0.5ml的外周血单核细胞悬液接种HF细胞进行体外细胞共培养的病毒分离;观察4周后,取培养物对HCMV UL83、IE基因进行PCR、RT-PCR和间接免疫荧光以确定三组小鼠的HCMV感染状态;(2)采用间接ELISA棋盘滴定法筛选各种纯度pp65抗原的特异性;(3)小鼠免疫状态检测:使用本室自制的pp65作为抗原包被酶标板,进行间接ELISA检测小鼠血清中的HCMV IgG、IgM抗体水平,流式细胞仪检测全血细胞中CD3+/CD4+/CD8+ T淋巴细胞亚群数量与比例变化。第二部分:从安徽医科大学第一附属医院及武警医院采集肾移植术后患者77份尿标本、78例血标本,按实验设计分别作如下处理:(1)HCMV病毒分离:将标本接种至人胚成纤维细胞(HF)上,观察病毒致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE);(2)采用PCR技术直接检测标本的HCMV IE、UL54及UL83基因;(3)分别使用pp65抗原组装的ELISA试剂盒、珠海海泰ELISA试剂盒以及意大利DIESS试剂盒检测77例患者血浆标本;(4)处理数据,分别将基因检测结果与意大利DIESS试剂盒的检测结果进行比较,以确定其对患者HCMV感染状态诊断中的参比标准诊断试剂盒地位,再以DIESS为参比,分析比较本室pp65试剂盒及国内海泰ELISA试剂盒的特异性和灵敏度。结果第一部分:(1)HCMV感染状态检测:三组病毒分离结果检测显示:只有B组中的4只小鼠的病毒分离结果可观察到HCMV复制增殖后出现CPE,该组细胞培养物PCR检测HCMV UL83 DNA为阳性,间接免疫荧光可观察到苹果绿色阳性信号;上述结果在A组和C组均为阴性;A组和B组白细胞直接PCR检测在766bp处均可见到HCMV UL83基因特异性条带,C组为阴性;但RT-PCR检测只有B组4份标本在766bp处显示有HCMV UL83基因的转录产物存在;(2)棋盘滴定显示只有精纯后的pp65作为抗原显示有特异性的反应,最适稀释度为1:40;(3)小鼠免疫状态检测:pp65截短抗原间接ELISA法检测小鼠血清中的IgG、IgM抗体水平,A、B两组小鼠IgG抗体各有6例为阳性,阳性率均为100%,C组为阴性;小鼠IgM抗体仅B组有4只小鼠为阳性,阳性率为66.67%,A、C组均为阴性。流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群显示,小鼠外周血中CD3+细胞比在A、B、C三组中的均值分别为33.05%±3.39%、6.58%±3.38%、43.18%±1.67%,组间差异有显著性(P<0.01);CD4+细胞比在A、B、C三组中的均值依次为66.08%±1.618%、59.98%±2.29%、65.78%±2.17%,B组和A组及C组差异均有显著性(P<0.01),而在A组和C组间无明显差异(P>0.05);CD8+细胞比在A、B、C三组中的均值依次为23.26%±2.99%、11.50%±2.79%、18.61%±0.94%,组间差异均有显著性(P<0.01);CD4+CD8+细胞比在A、B、C三组中的均值依次为9.90%±1.04%、16.82%±3.20%、11.92%±1.75%,组间差异均有显著性(P<0.05)。第二部分:(1)HCMV病毒分离结果显示均为阴性。(2)77份肾移植患者血标本HCMV PCR检测HCMV IE DNA, 67例为阳性,阳性率为87.0%;HCMV UL54 DNA共有9例阳性,阳性率为11.7%,HCMV UL83 DNA 10例阳性,阳性率为13.0%。78份尿标本HCMV UL83 PCR DNA检测共有13份阳性,阳性率为16.7%。(3)以意大利DIESS试剂盒作为参比试剂盒得到海泰HCMV IgM的灵敏度为7.7%,特异性为98.4%;本室pp65 HCMV IgM的灵敏度为15.4%,特异性为72.0%。(4)pp65 IgG和IgM ELISA试剂盒检测结果均为阳性的标本中有两份标本其他各项检测结果均为阴性。结论(1)因大剂量免疫抑制剂的使用,HCMV感染再激活小鼠出现了细胞免疫抑制状态,而在该免疫抑制的小鼠群体中,精纯的截短抗原pp65作为包被抗原进行ELISA检测抗体的结果与病毒分离及PCR,RT-PCR检测结果完全一致。提示精纯的pp65截短抗原可用于免疫抑制人群的HCMV IgG、IgM检测。(2)78例长期使用免疫抑制剂的肾移植患者中,经对HCMV多个基因UL83、UL54、IE DNA检测发现,有9名患者各项检测结果均为阳性,阳性率为11.5%,可判定这些患者呈现HCMV活动性感染;(3)在以DIESS ELISA试剂盒为参比试剂盒时,本室pp65 ELISA试剂盒其灵敏度为15.4%,较海泰试剂盒高一倍;特异性为72.0%,较海泰试剂盒的98.4%低。(4)基因检测均为阴性的患者标本pp65 IgM ELISA试剂盒检测结果为阳性,提示患者可能为HCMV原发感染,阳性率为2.6%,该pp65 IgM ELISA试剂盒有望用来诊断“窗口期”的HCMV原发感染。