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黄曲霉毒素(aflatoxin,AFs)是寄生曲霉等曲霉菌属真菌的次生代谢产物,包括黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)、黄曲霉毒素B2(aflatoxin B2,AFB2)、黄曲霉毒素G1(aflatoxin G1,AFG1)和黄曲霉毒素G2(aflatoxin G2,AFG2)等。干旱、高温等环境条件以及存储时间都会影响霉菌的生长和AFs的产生,在多种AFs中,AFB1的毒性最强,具有致癌、致畸、致突变的作用,饲料及其原料中往往含多种霉菌,一种霉菌也可产生多种毒素,赭曲霉毒素(Ochratoxin A,OTA)与黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1)毒性相当,同样存在于牛奶中。乳铁蛋白(lactoferrin,LF)是牛奶中的活性成分,也广泛存在于人体唾液、泪液、胆汁、血浆、粘膜以及生殖器的分泌物中,具有广谱抗细菌感染、调节骨髓细胞的生长、促进细胞生长和调节体内铁平衡等多种生理功能,其中抗氧化性对机体作用最突出。本文研究了OTA与AFM1对分化的Caco-2细胞联合毒性作用,AFM1和AFB1对肠、肝、肾和神经细胞损伤作用,以及LF对AFs毒性的抑制作用及其机理。主要研究内容及结论如下:1.AFM1和OTA单独及联合作用于分化的Caco-2细胞后,通过Alamar-Blue法测量细胞存活率,结果表明AFM1和OTA可抑制分化的Caco-2细胞增殖并诱导其凋亡,12μM AFM1和6μM OTA单独作用于Caco-2细胞存活率分别为95.59%和93.14%,联合作用下细胞存活率为81.57%,提示联合作用具有协同作用;通过流式细胞术检测细胞凋亡,AFM1和OTA单独处理细胞24h后,细胞的凋亡率分别为25.68%和33.7%,联合作用细胞的凋亡率为37.4%;活性氧荧光探针检测细胞活性氧(ROS)释放量,AFM1和OTA单独作用下细胞ROS的释放量分别是空白对照组的1.37倍和1.79倍,交互作用下释放量是空白对照组的6.21倍;JC-1线粒体膜电位荧光探针检测细胞线粒体膜电位变化;蛋白免疫印迹法检测凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达水平,结果表明AFM1和OTA可能通过线粒体凋亡途径诱导分化的Caco-2细胞凋亡。2.肠、肝、肾和神经细胞分别暴露在0.05-4μg/m L的AFB1或AFM1中,细胞存活率呈剂量依赖性降低趋势(p<0.05),毒素处理24 h后,AFB1对Caco-2、HEK293T和SK-N-SH细胞的存活率均低于相同条件下AFM1对细胞的处理,提示AFB1的细胞毒性高于AFM1,但在HEK 293T细胞结果却相反。3.肠、肝、肾和神经细胞分别暴露在10-100μg/m L的LF中,细胞的存活率不具有剂量依赖性(p<0.05),最适宜浓度为100μg/m L,乳酸脱氢酶(LDH)释放量的结果显示,LF的最适宜浓度为1000μg/m L,提高细胞谷胱甘肽(GSH)释放量证明LF发挥抗氧化作用,最适宜浓度为1000μg/m L。4.LF能否抑制AFB1和AFM1的毒性至今没有人研究,通过测量细胞存活率、LDH释放量、细胞抗氧化能力和DNA损伤研究AFB1和AFM1对肠、肝、肾和神经细胞的损伤作用和LF对AFB1和AFM1毒性的抑制作用,实验结果表明,浓度4μg/m L的AFB1和AFM1能够显著抑制Caco-2、HEK293T、Hep-G2和SK-N-SH细胞生长(p<0.05),促进LDH释放,增加细胞ROS生成,造成DNA损伤,AFB1对四种细胞毒性高于AFM1,尤其是对Hep-G2细胞。浓度为10、10和1000μg/m L的LF通过发挥抗氧化性作用,显著抑制AFB1和AFM1的氧化和DNA损伤作用。5.通过蛋白免疫印迹法检测相关蛋白表达量,结果表明,LF抑制AFB1和AFM1的氧化和DNA损伤作用机制与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中ERK1/2和JNK两种蛋白的表达相关。