论文部分内容阅读
目的：寻常型银屑病是一种常见的慢性复发性炎症性皮肤病,主要临床表现为皮肤红斑、斑块上覆盖银白色鳞屑,主要病理特征为表皮角质形成细胞过度增殖和真皮局部炎症细胞浸润。虽然至今为止,寻常型银屑病的确切病因和发病机制尚未完全阐明,但是众所周知,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α和白介素(interleukin, IL)-6在寻常型银屑病发病中发挥着关键的致炎作用。颗粒蛋白前体(Progranulin, PGRN)是一种多功能的分泌性生长因子,广泛表达于多种组织,尤其是快速生长的细胞中,参与胚胎发育、组织损伤修复、肿瘤发生、神经退行性变等多种病理生理过程。近年来发现PGRN还是一个多功能的免疫调节分子,可通过调节免疫反应中不同的关键性信号通路,在炎症性疾病中发挥抗炎或促炎作用。PGRN作为肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor, TNFR)的一种新配体,能通过拮抗TNF-α信号通路在类风湿性关节炎模型中发挥抗炎作用。而在肥胖和胰岛素抵抗性糖尿病小鼠模型中,PGRN则可以通过调节IL-6信号途径发挥促炎作用。但是,PGRN在寻常型银屑病中的作用至今尚不清楚。因此,本研究拟通过检测PGRN在寻常型银屑病病人和小鼠疾病模型中的表达,并观察PGRN缺陷后对银屑病样小鼠模型的影响,从而探讨PGRN在寻常型银屑病发病中的作用及机制。方法：收集临床标本：收集20例正常人的血浆和皮肤组织,以及34例临床和组织病理学检查确认的典型进展期寻常型银屑病患者皮损组织和治疗前后的血浆,并记录患者治疗前后的银屑病皮损面积和严重程度指数(Psoriasis Area and Severity Index, PASI)。检测患者皮损和血清中PGRN的表达：以免疫组织化学法和实时定量逆转录—聚合酶链反应(Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)分别检测正常人和寻常型银屑病患者皮损中PGRN蛋白表达和mRNA的水平。以酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测正常人和寻常型银屑病患者治疗前后血浆中PGRN、TNF-α和IL-6的水平。建立寻常型银屑病样小鼠模型：选择10—12周龄的健康雄性C57BL/6小鼠,以0.01%豆蔻酰佛波醇乙酯(12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate, TPA)溶液涂抹小鼠耳部皮肤,诱导小鼠耳部皮肤发生寻常型银屑病样炎症,建立寻常型银屑病的小鼠模型。检测小鼠模型中PGRN的表达：以免疫组织化学法和qRT-PCR法分别检测未经处理的野生鼠和寻常型银屑病样小鼠耳部皮损中PGRN蛋白和mRNA表达水平。检测PGRN的作用及对CD4+T细胞亚群的影响：选择10—12周龄的雄性C57BL/6遗传背景的PGRN缺陷小鼠,以0.01%TPA溶液涂抹小鼠耳部皮肤,分别从组织病理和临床表现上观察小鼠耳部皮肤发生寻常型银屑病样炎症的程度,并以流式细胞术检测TPA处理后PGRN缺陷鼠和野生鼠颈部淋巴结和耳部皮损中Th1(CD4+IFN-γ+)、Th2 (CD4+IL-4+)、Th17 (CD4+IL-17+)和Treg (CD4+CD25+FoxP3+)细胞的水平。结果：与正常皮肤组织相比,寻常型银屑病患者皮损中PGRN的蛋白表达和mRNA的水平均有明显升高。寻常型银屑病患者血浆中PGRN蛋白含量显著高于正常人,且治疗后患者血浆中PGRN含量明显降低。寻常型银屑病患者血浆中TNF-α和IL-6水平均显著高于正常人,且血浆中TNP-α水平与PGRN水平呈显著正相关,但IL-6水平与PGRN水平无显著相关性。寻常型银屑病患者血浆中PGRN/TNF-α的比值与PASI评分呈显著负相关。野生C57BL/6小鼠经0.01% TPA溶液涂抹耳朵后,耳部皮肤出现明显的红斑、鳞屑和增厚,组织病理表现出棘细胞层增厚、表皮突延长、角化不全、表皮微脓肿、表皮下炎症细胞浸润。其临床表现和组织病理均类似寻常型银屑病病人,成功建立寻常型银屑病小鼠模型。与未经TPA处理的野生鼠相比较,寻常型银屑病样小鼠耳部皮损中PGRN蛋白表达和mRNA的水平均有明显升高。PGRN缺陷鼠经0.01% TPA溶液涂抹耳朵后,其耳部皮肤表现出比野生鼠更明显的红斑、鳞屑和增厚,组织病理显示表皮增厚、表皮微脓肿、真皮毛细血管增生和炎症细胞浸润等现象更严重。PGRN缺陷鼠的临床表现和组织病理均表现出比野生鼠更强的银屑病样炎症反应。TPA处理后的PGRN缺陷鼠颈部淋巴结和耳部皮损中Treg (CD4+CD25+FoxP3+)细胞占CD4+T细胞的比例较野生鼠明显降低,但两组小鼠Th1(CD4+IFN-γ+)、Th2(CD4+IL-4+)、Th17(CD4+IL-17+)细胞的比例无明显差异。结论：PGRN参与了寻常型银屑病的发病过程,且通过增加皮损和局部淋巴结中Treg细胞的数量,在寻常型银屑病中发挥抗炎性保护作用。寻常型银屑病病人血浆中PGRN/TNF-α的比值是一个较好的反映疾病严重程度的指标。PGRN作为一种内源性的抗炎因子,在寻常型银屑病中虽然升高,但不足以阻断疾病的进展,外源性补充PGRN能否缓解病情,值得我们进一步研究。